王賽丹，陳齊亮，孫認(rèn)認(rèn)，李濤，任保增

（鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南鄭州450001）

香根草又名巖蘭草，是禾木科巖蘭屬的一種多年生草本植物[1]。原產(chǎn)自斯里蘭卡和印度，后被引種到海地、波蘭和中國(guó)等地并被廣泛種植。其根部能散發(fā)出怡人的香味，提取得到的香根油，由于味道清新、怡人而被廣泛用于香水化妝品工業(yè)[2]。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于香根油提取工藝的研究，例如，龔德慎等[3]用水蒸氣蒸餾法對(duì)黔產(chǎn)香根草蒸餾11 h左右，并用石油醚萃取回收殘?jiān)?，得香氣較好的0.8%的香根油，但提取率較低；Martinez等[4]對(duì)巴西產(chǎn)香根草干燥磨粉后分別經(jīng)液氮碾磨、NaOH溶液及酶處理后，再水蒸氣蒸餾16 h，得到提取率約為1.8%的香根油；朱自仁等[5]采用有機(jī)溶劑提取法連續(xù)浸提兩次，提取率達(dá)到了15.21%左右，但提取時(shí)間較長(zhǎng)，且未經(jīng)除雜處理，所以所得精油顏色較深；本課題組廖耀華等[6]利用超臨界CO2萃取法，得到提取率為7.78%的香根油，但是，其提取過程中沒有進(jìn)行除雜、提取工藝比較繁瑣、成分分析不夠完善。

超聲波輔助提取技術(shù)是指利用超聲波的能量破除植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而加速溶質(zhì)溶出擴(kuò)散，提高植物有效組分從固相到液相的傳質(zhì)速率，實(shí)現(xiàn)精油的高效提取[7-8]。本研究以河南南陽(yáng)地區(qū)的香根草為原料，采用超聲波輔助有機(jī)溶劑法提取法，利用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取過程進(jìn)行優(yōu)化，篩選出香根油的較優(yōu)提取工藝參數(shù)，并對(duì)香根油的成分進(jìn)行比較完善的分析，以期為香根草提取香根油的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

香根草：采摘自河南南陽(yáng)淅川縣；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷等試劑均為分析純。

FA2014N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；SHZ-D（III）真空泵：河南省予華儀器有限公司；KQ-500DE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市英峪高科儀器廠；20×200/24層析柱：中原玻璃儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 萃取工藝流程

香根草根須→蒸餾水反復(fù)清洗→40℃電熱鼓風(fēng)干燥箱烘干32 h→粉碎過篩→超聲波萃取兩次→合并提取液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→少量乙醇溶解→冷凍除雜→微孔濾膜過濾→旋蒸至恒重→計(jì)算粗提油提取率→硅膠純化→流出液體濃縮→計(jì)算精油提取率

1.2.2 香根油提取率計(jì)算

香根油提取率的計(jì)算如式（1）所示：

式中：m1為香根油的質(zhì)量，g；m2為香根草的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

選取有機(jī)溶劑、粒徑、料液比（g/mL）、超聲時(shí)間（min）和超聲溫度（℃）5個(gè)單因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)?？疾旄饕蛩貙?duì)香根草油提取率的影響，試驗(yàn)均平行3次取均值。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以Box-Behnken法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取料液比、超聲時(shí)間和和超聲溫度3個(gè)影響因子（其他因子均選擇單因素最佳值進(jìn)行試驗(yàn)），響應(yīng)值為香根草油的提取率，設(shè)計(jì)出了三因素三水平的試驗(yàn)，因素水平見表1。并運(yùn)用Design-Expert.8.06b軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，考察各因素交互作用。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Variables and levels in the response surface experiment design

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

驗(yàn)證響應(yīng)面分析得到的最優(yōu)預(yù)測(cè)值，平行試驗(yàn)3次，并計(jì)算此條件下香根草油的平均提取率，與預(yù)測(cè)值比較。

1.2.6 GC-MS聯(lián)用分析香根油成分

色譜分析條件：GsBP-35 ms毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；初始柱溫為50℃，程序升溫，以15℃/min至160℃，以1℃/min至195℃，以15℃/min至260℃，保持3min，氦氣作載氣，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比20∶1，柱流速1.0 mL/min。溶劑延遲：3.2 min。

質(zhì)譜：EI（70 eV），接口和離子源的溫度分別為250℃和220℃，掃描范圍：40 aum~500 aum。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 有機(jī)溶劑對(duì)香根油提取率的影響

在粒徑為 80目~100目，料液比 1∶15（g/mL），超聲溫度50℃，超聲時(shí)間為30 min條件下，研究不同提取劑對(duì)香根草油提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，不同有機(jī)溶劑提取效果不同，正己烷和石油醚為非極性有機(jī)溶劑，而香根油中的倍半萜類主要揮發(fā)性香氣成分一般為弱極性或中等極性的物質(zhì)，根據(jù)相似相溶原理，應(yīng)較易溶出，故純化前后提取率變化不大，色澤上為淺黃色油狀液體、清澈透明，且有濃郁的木香和厚重的清香，但提取率比較低。當(dāng)以無水乙醇為溶劑時(shí)，香根油的提取率最大為3.02%，而且所得精油色澤澄清透亮、香味濃郁持久，品質(zhì)較佳，故選取無水乙醇作為提取溶劑。

表2 不同有機(jī)溶劑提取香根草精油的效果比較Table 2 The effects comparison of different organic solvent on the extraction of vetiver essential oil

2.1.2 粒徑對(duì)香根油提取率的影響

以無水乙醇為提取溶劑，其它條件同2.1.1的條件下，研究不同粒徑對(duì)香根草油提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 粒徑對(duì)香根草油提取率的影響Fig.1 Effect of grinding granularity on yield of vetiver essential oil

由圖1可知，香根草精油的提取率隨粒徑目數(shù)的增大而呈上升趨勢(shì)，當(dāng)粒徑為80目~100目時(shí)，提取率為3.08%，繼續(xù)增大粒徑目數(shù)時(shí)，提取率基本保持不變，而且會(huì)提高研磨粉碎成本，故本試驗(yàn)選擇粒徑為80目~100目。

2.1.3 料液比對(duì)香根油提取率的影響

在粒徑為80目~100目，其它條件同2.1.2時(shí)，研究不同料液比對(duì)香根草油提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)香根油提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of vetiver essential oil

由圖2知，當(dāng)料液比低于1∶10（g/mL）時(shí)，香根油提取率隨著料液比的增大而增加，在1∶10（g/mL）時(shí)達(dá)到最大，為3.01%。這可能是因?yàn)樵黾尤軇┯昧繒r(shí)，溶劑中香根油的濃度會(huì)降低，從而增大了香根草精油與溶劑接觸界面處的濃度差，即增大了傳質(zhì)推動(dòng)力，提高了傳質(zhì)速率[9]。隨著料液比的增加，不僅會(huì)增加溶劑用量造成不必要的浪費(fèi)，而且會(huì)增加旋蒸濃縮時(shí)間，造成精油在溶劑中的揮發(fā)損失。故綜合考慮，選擇料液比為 1∶10（g/mL）。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)香根油提取率的影響

在料液比 1∶10（g/mL），其它條件同 2.1.3 時(shí)，考察不同超聲時(shí)間對(duì)香根草油提取率的影響，結(jié)果如圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)香根草油提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on yield of vetiver essential oil

由圖3知，隨著超聲時(shí)間的增加，香根草油的提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在30 min時(shí)達(dá)到最大，為3.07%。這是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)加劇細(xì)胞破碎度，利于香根草油在有機(jī)溶劑中的溶出。而繼續(xù)延遲超聲處理時(shí)間，香根草油的提取率基本保持不變。因此，超聲處理時(shí)間選擇30 min。

2.1.5 超聲溫度對(duì)香根油提取率的影響

在超聲時(shí)間為30 min，其它條件同2.1.4時(shí)，考察不同提取溫度對(duì)香根草油提取率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4知，香根油提取率隨著超聲溫度的增加而增加，在60℃時(shí)達(dá)到最大，為3.34%。繼續(xù)增加溫度，提取率反而下降。這可能是因?yàn)?，?dāng)溫度過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致香根草油中熱敏性物質(zhì)的氧化及揮發(fā)，從而造成提取率的下降。另外，升高溫度則會(huì)加大能耗和成本，故綜合考慮選擇超聲溫度為60℃。

圖4 超聲溫度對(duì)香根草油提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on yield of vetiver essential oil

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，利用Design－Expert 8.0.6軟件中的Box－Behnken模型進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平見表1，試驗(yàn)過程中選取料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間為響應(yīng)變量，以硅膠純化后的香根油的提取率為響應(yīng)值。試驗(yàn)方案及結(jié)果如表3所示，對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，所得回歸方程如下式2，其中提取率（%）記作Y，回歸方程的方差分析結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

表4是該模型的回歸方差分析表。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression equation

從表4中可以得出，二次回歸模型的F值是34.05，P＜0.000 1，表明該二次回歸模型達(dá)到了極其顯著水平，可以用該模型來描述響應(yīng)值與各個(gè)因素之間的函數(shù)關(guān)系；失擬項(xiàng)P=0.110 7＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，該模型可以充分反映實(shí)際情況；試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷南嚓P(guān)系數(shù)R2為0.977 7，表明試驗(yàn)結(jié)果與該二次回歸模型得到的預(yù)測(cè)結(jié)果差異較小，兩者有著良好的一直性，該模型的校正系數(shù)RAdj2=0.949 0，表明響應(yīng)值的變化受所選試驗(yàn)因素影響較大。因此，可以用該模型對(duì)香根草油提取率的結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。表4中F值的大小可以判斷自變量對(duì)因變量的影響程度大小，由此可以得出各因素對(duì)香根草油提取率的影響主次順序是A＞C＞B，即在所選定的試驗(yàn)范圍內(nèi)料液比對(duì)香根草油提取率的影響最大，其次是超聲溫度，超聲時(shí)間對(duì)香根草油提取率的影響最小。由表還可以看出，一次項(xiàng)中超聲溫度和料液比對(duì)香根草油提取率的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），超聲時(shí)間對(duì)香根草油的提取率影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；該模型的交互項(xiàng)中AC香根草油的提取率影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），表明超聲溫度和料液比之間存在著顯著的交互作用；二次項(xiàng)中A2和C2對(duì)香根草油提取率的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對(duì)香根油提取率的影響見圖5。

響應(yīng)面是描述在其它因素恒定的情況下，來考察兩個(gè)因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，響應(yīng)面的坡度越陡峭對(duì)響應(yīng)值的影響就越顯著，當(dāng)響應(yīng)面的等高線越接近橢圓時(shí)，表明兩因素的交互作用越顯著[10-11]。

圖5 各因素交互作用對(duì)香根油提取率的影響Fig.5 Response surface graphs showing the effect of extraction conditions on the yield of vetiver oil

圖5 A~C是反應(yīng)各因素交互作用對(duì)香根油提取率的影響。其中圖5 A是顯示在超聲溫度為60℃時(shí)，料液比和超聲時(shí)間對(duì)香根草油提取率的影響，由圖可知：香根草油的提取率隨著料液比和超聲時(shí)間的增加均有先增加后減小的趨勢(shì)，表明兩者對(duì)香根草油提取率的影響均顯著，與方差分析結(jié)果一致，其中，料液比的變化曲面比超聲時(shí)間的變化曲面更為陡峭，表明料液比對(duì)香根草油的提取率的影響更為顯著；圖5 B是在超聲時(shí)間為30 min時(shí)，料液比和超聲溫度對(duì)香根草油提取率的影響，由圖可知兩者的變化曲面都很陡峭，表明料液比和超聲溫度對(duì)香根油的提取均極其顯著；圖5 C是在料液比為30 min時(shí)，超聲溫度和時(shí)間對(duì)香根草油提取率的影響，由圖可知隨著溫度和時(shí)間的增加，香根草油的提取率先增加后減小，而且超聲溫度的變化曲面更為陡峭一些，表明超聲溫度對(duì)香根草油的提取率更為顯著一些，與方差分析結(jié)果一致。由圖5 A~C的底部等高線投影圖中可以看出，B中的等高線更接近于橢圓[12]，表明料液比和超聲溫度交互作用較為顯著，對(duì)香根草油提取率的影響結(jié)果較大。

2.2.3 最優(yōu)點(diǎn)驗(yàn)證

利用Design-Expert 8.0.6軟件得到香根油的較優(yōu)提取工藝參數(shù)分別為料液比為1∶12.22（g/mL）、超聲提取時(shí)間35 min、提取溫度67.92℃，香根油的提取率最大達(dá)到3.35%。鑒于實(shí)際的生產(chǎn)過程，將較優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行一些調(diào)整，調(diào)整后的提取工藝參數(shù)分別為料液比為1∶12（g/mL）、超聲提取時(shí)間35 min、提取溫度68℃，在此工藝參數(shù)下，平行進(jìn)行3次試驗(yàn)，得到香根油的提取率為3.21%，和模型預(yù)測(cè)值3.35%非常接近，表明這個(gè)模型可以很有效的評(píng)價(jià)香根油的提取過程。

2.2.4 香根油的GC-MS分析

超聲波輔助有機(jī)溶劑法提取香根油的總離子流色譜圖如圖6所示。

所得質(zhì)譜圖譜經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)照、人工圖譜分析及可靠性篩選后，初步確認(rèn)了其中部分主要目標(biāo)組分的化學(xué)成分，分析結(jié)果如表5所示。

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)最優(yōu)工藝參數(shù)下制備的香根油進(jìn)行化學(xué)成分分析，結(jié)果如圖6和表5所示。從超聲波輔助溶劑提取法制得香根油中共鑒定出22種相對(duì)百分含量較多的目標(biāo)組分，幾乎均為倍半萜及其氧化物，占?xì)庀喑龇蹇傒腿∥锏?6.96%。其中[13-15]屬于倍半萜醇類的化合物7種，總相對(duì)含量為33.95%，它們分別是：β-桉葉醇、胡木烷 -1，6-二烯-3-醇、?客素醇、α-異杜松醇、巖蘭醇、客烯醇和異朱欒倍半萜醇；屬于倍半萜酮類的化合物7種，總相對(duì)含量為22.28% ， 它 們 分 別 是 ：4αβ 甲 基 - 反 -3，4，4a，5，6，7，8，9-四氫-2H-苯并環(huán)丁烯-2-酮、菖蒲螺烯酮、長(zhǎng)葉松香芹酮、β-巖蘭酮、香柏酮、α-巖蘭酮及倍半萜烯酮；屬于倍半萜羧酸類的化合物1種，即巖蘭酸，占總相對(duì)含量的12.87%；屬于倍半萜烯烴的化合物烴類的化合物7種，總相對(duì)含量為7.83%，它們分別是：α-紫穗槐烯、佛術(shù)烯、β-杜松烯、β-朱欒、α-愈創(chuàng)木烯、長(zhǎng)葉烯和δ-桉葉烯。這些被鑒定出的化學(xué)組分多是各種食品添加劑、香料、中草藥等的有效組分，如β-巖蘭酮帶有濃郁的木質(zhì)異香的果香兒，可用于制備一些特殊的香料。

圖6 超聲波輔助有機(jī)溶劑法提取香根草油的總離子流色譜圖Fig.6 Ultrasonic assisted organic solvent extraction of vetiver oil total ion current chromatogram

表5 超聲波輔助有機(jī)溶劑法提取提取香根草油的GC-MS分析結(jié)果Table 5 The GC-MS analysis results of vetiver oil

3 結(jié)論

以河南南陽(yáng)香根草為原料，利用超聲波輔助有機(jī)溶劑萃取法提取香根油，得到其較優(yōu)的工藝參數(shù)：料液比為1∶12（g/mL），超聲時(shí)間為35 min，超聲溫度為68℃。在此工藝參數(shù)條件下，平行試驗(yàn)3次得到香根油的提取率為3.21%。響應(yīng)面結(jié)果表明，3個(gè)因素對(duì)香根油提取率影響大小順序?yàn)椋毫弦罕龋境暅囟龋境晻r(shí)間，其中料液比和超聲溫度兩個(gè)因素的交互作用較為顯著。采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)對(duì)純化后得到的香根草油進(jìn)行了成分分析，初步確定了其中22種主要組分化合物及各組分的相對(duì)百分含量。本研究提取工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，可為南陽(yáng)等地的香根草綜合利用提供試驗(yàn)參考。

[1] 毛萍,楊宏,馬欣榮.香根草的研究及利用進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2011,13(1):88－93

[2] Danha L T,Truongc P,Mammucaria R,et al.Extraction of vetiver essential oil by ethanol－modified supercritical carbon dioxide[J].Chemical Engineering Journal,2010,165(1):26－34

[3] 龔德慎,魏德生,鐘雁,等.黔產(chǎn)香根油的研究[J].貴州科學(xué),1997,15(2):126－130

[4] Martinez J,Rosa P T,Menut C,et al.Valorization of Brazilian Vetiver(Vetiver zizanioides(L.)Nash ex Small)Oil[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(21):6578－6584

[5] 朱自仁,何有昌,張淑.香根油的提取和浸膏的試制試驗(yàn)報(bào)告[J].四川日化,1990(4):38－41

[6]廖耀華,王丹,王寶慶,等.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化香根草油的超臨界CO2萃取工藝及其萃取物分析[J].食品科學(xué),2015,36(20):79－85

[7] Tekin K,Akalln M K,■eker M G.Ultrasound bath－assisted extraction of essential oils from clove using central composite design[J].Industrial Crops&Products,2015,77:954－960

[8] 袁敏,郭應(yīng)貴,楊興兵.超聲波提取花椒揮發(fā)油的研究[J].廣州化工,2010,38(1):98－99

[9] Hugenholtz J,Sybesma W,Groot M N,et al.Metabolic engineering of lactic acid bacteria for the production of nutraceuticals[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2002,82(1/4):217

[10]張聲源,鄒浩元,楊宇輝,等.響應(yīng)面法優(yōu)化金柚核中類檸檬苦素的提取工藝[J].食品研究與開發(fā),2017,38(9):65－69

[11]Dong C H,Xie X Q,Wang X L,et al.Application of Box－Behnken design in optimisation for polysaccharides extraction from cultured mycelium of Cordyceps sinensis[J].Food&Bioproducts Processing,2009,87(2):139－144

[12]李斌,雷月,孟憲軍,等.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取藍(lán)靛果多酚工藝及其抗氧化活性[J].食品科學(xué),2015,36(22):33－39

[13]Weyerstahl P,Marschall H,Splittgerber U,et al.Constituents of Haitian vetiver oil[J].Flavour&Fragrance Journal,2000,15(6):395－412

[14]Peter W,Helga M,Ute S,et al.Analysis of the polar fraction of Haitian vetiver oil[J].Flavour&Fragrance Journal,2000,15(3):153－173

[15]Celestino R S,Zucchi M I,Pinheiro J B,et al.Molecular and chemical characterization of vetiver,Chrysopogon zizanioides(L.)Roberty,germplasm[J].Genetics&Molecular Research Gmr,2015,14(3):9452－9468

[16]Lavania U C.Other Uses,and Utilization of Vetiver:Vetiver Oil[C].Guangzhou:The Third Int.Conference on Vetiver and Exhibition,2003:486－491

[17]Paillat L,Périchet C,Pierrat J P,et al.Purification of vetiver alcohols and esters for quantitative high－performance thin－layer chromatography determination in Haitian vetiver essential oils and vetiver acetates[J].Journal of Chromatography A,2012,1241(11):103－111