魏 薇， 常福祥， 孫建中， 王錢錢,2,3*

(1. 江蘇大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院;生物質(zhì)能源研究所， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè) 研究所；江蘇省 生物質(zhì)能源與材料重點實驗室， 江蘇 南京 210042； 3.中國科學(xué)院 廣州能源研究所； 廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點實驗室， 廣東 廣州 510640)

乙醇是一種可以通過糖發(fā)酵獲得的可再生能源。在美國，乙醇已經(jīng)被廣泛用作特殊的石油替代品。第一代燃料乙醇是淀粉乙醇，多采用糧食作物為原料，造成了食品價格增長與耕地的占用，將能源危機轉(zhuǎn)變成了食品危機[1]。另外，有學(xué)者指出生產(chǎn)淀粉乙醇所需的熱能主要由化石燃料提供，這使得溫室氣體排放并未得到改觀甚至還有所增長[2]。上述缺陷讓國際社會將更多目光投向第二代燃料乙醇，即纖維素乙醇。纖維素乙醇以非糧木質(zhì)纖維為原料，整合先進的生物精煉與廢氣處理工藝，實現(xiàn)液體燃料生產(chǎn)的同時降低溫室氣體排放[3-4]。木質(zhì)纖維是地球上最豐富的可再生資源，主要來自于木材和農(nóng)業(yè)廢棄物，既可以用于制備生物乙醇、生物氫氣等生物能源[5-7]，同時也可以用于制備各種化工原料及生物基材料[8-10]，將其轉(zhuǎn)化為燃料乙醇，避免食品危機的產(chǎn)生[11]。此外，木質(zhì)纖維具有產(chǎn)量高、分布廣、綠色、環(huán)保、可再生等特點[12]，使得它在制備生物乙醇和化工原料方面具有廣闊的應(yīng)用空間[13]。然而，由于木質(zhì)纖維復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和多樣性，使其轉(zhuǎn)化效率受到一定限制[14]。木質(zhì)纖維制備生物乙醇一般需要經(jīng)過預(yù)處理、酶解糖化和發(fā)酵3個過程。預(yù)處理的目的是破壞纖維細胞的致密結(jié)構(gòu)，提高底物后續(xù)酶解轉(zhuǎn)化率。酶解糖化過程是將纖維素水解為低聚糖和單糖，同時降低水解產(chǎn)物的黏性，使水解產(chǎn)物更易攪拌[15]。木質(zhì)纖維底物的酶解糖化是一個復(fù)雜的多相催化反應(yīng)，不僅受到底物和纖維素酶自身性質(zhì)的影響，同時還與纖維素酶在底物上的吸附、滲透等傳質(zhì)過程密切相關(guān)[16]。木質(zhì)纖維原料經(jīng)預(yù)處理和酶解糖化之后，通過酵母菌發(fā)酵得到生物乙醇。傳統(tǒng)的分步酶解糖化發(fā)酵(SHF)是指預(yù)處理后的原料先經(jīng)酶解糖化生成葡萄糖，然后在另一反應(yīng)器中進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇。SHF主要優(yōu)點是糖化和發(fā)酵都能在各自最優(yōu)的條件下進行[17]，缺點是糖化產(chǎn)物葡萄糖和纖維二糖的積累會抑制纖維素酶的活力，導(dǎo)致產(chǎn)率降低，而發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的過程中，高濃度的乙醇會抑制酵母的活性，降低乙醇產(chǎn)率。為了彌補SHF工藝的不足，有研究者開發(fā)出了木質(zhì)纖維“一鍋法”制備生物乙醇的新方法。“一鍋法”包括預(yù)處理與酶解糖化“一鍋法”，酶解糖化與發(fā)酵“一鍋法”，酶制備、酶解糖化與發(fā)酵“一鍋法”以及預(yù)處理、酶解糖化與發(fā)酵“一鍋法”等。筆者對以上4種“一鍋法”制備生物乙醇的方法進行了介紹，并分析了各自的國內(nèi)外研究進展，旨在為木質(zhì)纖維“一鍋法”制備生物乙醇的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 預(yù)處理與酶解糖化“一鍋法”

圖1為傳統(tǒng)工藝和預(yù)處理與酶解糖化“一鍋法”制備生物乙醇的對比。從圖1(a)中可以看出，傳統(tǒng)工藝制備生物乙醇，預(yù)處理、酶解糖化和發(fā)酵都是獨立的操作單元。這種工藝預(yù)處理后需要大量的水洗去木質(zhì)纖維表面的化學(xué)殘留物，存在水資源浪費和廢棄物難以處理的問題。為了解決這一問題，有研究者提出了預(yù)處理與酶解糖化“一鍋法”，工藝流程如圖1中(b)所示。從圖1(b)中可以看出，“一鍋法”制備生物乙醇過程中，預(yù)處理與酶解糖化在同一反應(yīng)器中進行，酶解后直接提取出糖，獲得木質(zhì)素并回收化學(xué)溶劑，不僅節(jié)省費用，同時可以提高發(fā)酵條件的穩(wěn)定性。

Shi等[13]采用預(yù)處理與酶解糖化“一鍋法”，使用離子液體[C2mim][OAc]對柳枝稷進行預(yù)處理，研究了不同預(yù)處理溫度和時間對預(yù)處理效果的影響。預(yù)處理后的底物，無需水洗直接稀釋至離子液體體積分數(shù)為10 %和20 %，每克底物中加入5.75 mg的耐高溫纖維素酶JTherm酶，在50和70 ℃下分別進行酶解。研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理溫度對預(yù)處理效果影響較小，160 ℃預(yù)處理3 h可以實現(xiàn)最優(yōu)的預(yù)處理效果。在離子液體體積分數(shù)為10 %，70 ℃酶解72 h后，葡聚糖轉(zhuǎn)化率為81.2 %，木聚糖轉(zhuǎn)化率為87.4 %，通過濕法萃取可將90 %的木聚糖和葡聚糖分離。采用預(yù)處理與酶解糖化“一鍋法”制備生物乙醇與“分步法”相比，可以節(jié)省70 %～90 %的水。Auxenfans等[14]將棉花中的纖維素在[Emim]+[MeO(H)PO2]-離子液體中進行預(yù)處理，加入里氏木霉(Trichodermareesei)纖維素酶，使得纖維素的最終質(zhì)量分數(shù)為2 %，纖維素酶用量為1 g/L，研究不同的離子液體用量對酶水解的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在離子液體為10 %，40 ℃酶解90 h時，葡聚糖的轉(zhuǎn)化率為(68±6)%。Liszka等[18]研究了一種基于二羧酸的新型離子液體，使用膽堿氫氧化物作為陽離子、水中的游離酸作為陰離子，在室溫中反應(yīng)15 min，用活性炭去除雜質(zhì)，該過程預(yù)處理效率高并且對商業(yè)酶混合物和微生物發(fā)酵宿主生物體影響小。研究表明，使用離子液體預(yù)處理柳枝稷，液固比為20∶1(mL∶g)，120 ℃條件下預(yù)處理3 h，預(yù)處理后直接酶解，在每克底物中加入20 mg纖維素酶CTec2和HTec2的混合酶(用量為9∶1)，50 ℃條件下酶解72 h，可發(fā)酵糖的轉(zhuǎn)化率為90 %。Wahlstr?m等[19]使用深度共熔溶劑(DES)和[EMIM]AcO預(yù)處理桉木，80 ℃預(yù)處理24 h。預(yù)處理后，在45 ℃水浴鍋中，使用緩沖液將DES和[EMIM]AcO稀釋至30 %或80 %；加入T.reesei酶進行酶解，每克底物中加入15 mg酶，45 ℃酶解48 h。研究發(fā)現(xiàn)，DES存在下的水解產(chǎn)率顯著高于[EMIM]AcO溶液。

圖 1 傳統(tǒng)工藝制備生物乙醇(a)與“一鍋法”制備生物乙醇(b)對比Fig. 1 Comparison of traditional process(a) and “one-pot” method(b) for ethanol production

2 酶解糖化與發(fā)酵“一鍋法”

2.1同步糖化發(fā)酵

同步糖化發(fā)酵(SSF)工藝是經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維原料的水解與發(fā)酵過程在同一容器中連續(xù)同時進行的發(fā)酵方法，該方法主要改善了分步水解發(fā)酵中糖對纖維素酶的抑制作用以及乙醇對酵母的抑制作用，這是因為第一步糖化反應(yīng)產(chǎn)生的葡萄糖會立即被利用發(fā)酵成乙醇，使整個反應(yīng)連續(xù)起來[20]。該方法不但能夠提高水解效率、提高產(chǎn)量，還能夠減少纖維素酶的用量、縮短反應(yīng)時間[21]。然而同步糖化發(fā)酵工藝的缺點是水解最適溫度和發(fā)酵最適溫度不一致，因為纖維素酶活性最佳的溫度是45～55 ℃，而一般酵母發(fā)酵的最佳溫度是25～37 ℃，同時發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙醇也會抑制微生物的活性，需要選取耐酒精性較好的微生物。

Karimi等[22]運用SSF工藝，以稻草為原料制備生物乙醇，研究發(fā)現(xiàn)：在發(fā)酵2～3 d后乙醇產(chǎn)量達到最大值，乙醇的總回收率為SSF乙醇最大產(chǎn)率的40 %～74 %。使用米根霉(Rhizopusoryzae)進行乙醇發(fā)酵，可以獲得的最大乙醇產(chǎn)率為74 %。Lee等[23]使用質(zhì)量分數(shù)為0.06 %的硫磺酸在170 ℃條件下預(yù)處理海帶15 min，去除海帶中的非葡聚糖成分。使用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)DK410362，在纖維素酶15 FPU/g以及β-葡萄糖苷酶70 IU/g條件下，采用SSF工藝進行發(fā)酵，研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過預(yù)處理后葡聚糖的酶解轉(zhuǎn)化率為83.96 %，發(fā)酵后獲得的生物乙醇質(zhì)量濃度為6.65 g/L,相當于葡聚糖質(zhì)量濃度為13.01 g/L。水解產(chǎn)物中甘露醇和藻酸鹽低聚糖可以應(yīng)用于其他發(fā)酵。Pessani等[24]研究了SSF工藝中酶添加量和溫度對經(jīng)過熱液預(yù)處理的柳枝稷發(fā)酵產(chǎn)乙醇效果的影響，選擇耐高溫釀酒酵母(Kluyveromycesmarxianus)IMB3，底物質(zhì)量分數(shù)為8 %。結(jié)果表明：纖維素酶Accellerase 1500酶的活性為82.2 FPU/g，添加量為0.7 mL/g，溫度為45 ℃時可以獲得最高的乙醇產(chǎn)量，發(fā)酵168 h后乙醇的產(chǎn)率為86 %。吉驪等[25]研究了糠醛渣經(jīng)不同強度綠液-過氧化氫預(yù)處理脫木質(zhì)素后，與木薯渣混合進行同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇。同步糖化發(fā)酵條件為無患子皂素表面活性劑添加量0.5 g/L，纖維素酶用量12 FPU/g，纖維二糖酶用量15 IU/g，預(yù)處理后的糠醛渣與木薯渣(質(zhì)量比為2∶1)混合作為底物，底物質(zhì)量濃度200 g/L時，發(fā)酵120 h最終乙醇質(zhì)量濃度可達56.6 g/L，乙醇得率為86.3 %。

2.2同步糖化共發(fā)酵

同步糖化共發(fā)酵(SSCF)是由同步糖化發(fā)酵衍生出來的工藝，將對戊糖和己糖都有發(fā)酵能力的菌群復(fù)合進行發(fā)酵，以提高乙醇的生產(chǎn)效率[26]。因為通常情況下木糖對纖維素酶水解纖維素有一定的抑制作用，而采用這種在發(fā)酵己糖的同時發(fā)酵戊糖的方式一方面可以減少木糖的抑制作用、增加酶的活性，另一方面也提高了單糖的利用率、提高乙醇的產(chǎn)率。同時，這種方法由于酶水解、葡萄糖發(fā)酵、木糖發(fā)酵過程同時進行，也進一步節(jié)約了成本。

Suriyachai等[27]將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和樹干畢赤酵母(Scheffersomycesstipitis)聯(lián)合培養(yǎng)，通過SSCF法發(fā)酵稻稈生產(chǎn)乙醇。研究發(fā)現(xiàn)，底物質(zhì)量分數(shù)為5%,S.cerevisiae和S.stipiti細胞比率為0.31，攪拌速率為116 r/min，發(fā)酵溫度33.1 ℃，可以達到最優(yōu)的發(fā)酵效果。此時乙醇的質(zhì)量濃度為15.2 g/L，乙醇產(chǎn)量為理論值的99 %。Jin等[28]運用SSCF工藝發(fā)酵經(jīng)氨纖維爆破(AFEXTM)預(yù)處理過的玉米秸稈，研究發(fā)現(xiàn)，利用S.cerevisiae424A(LNH-ST)發(fā)酵過程中，木聚糖的消耗與S.cerevisiae424A(LNH-ST)的活性極其相關(guān)，預(yù)處理后葡聚糖的濃度影響細胞活性，進而影響木聚糖的發(fā)酵，未被水解的底物對細胞的生長沒有抑制作用，SSCF體系中最佳發(fā)酵溫度為45 ℃。Olofsson等[29]通過控制SSCF過程中加入纖維素酶的量來提高木聚糖轉(zhuǎn)化率，從而提高其轉(zhuǎn)化為生物乙醇的效率。該方法在處理木聚糖含量豐富的原料時可以大大提高生物乙醇的產(chǎn)量。陳坤等[30]在纖維素酶20 FPU/g、發(fā)酵溫度38 ℃、接種量15 %、管囊酵母和釀酒酵母的接種比例2∶1 條件下，選擇不同的固液比(1∶5、1∶10、1∶15 和1∶20)，研究了稻草秸稈同時糖化法產(chǎn)乙醇的情況。結(jié)果表明：固液比1∶15時，獲得了較高的乙醇產(chǎn)率，為18.3 %。

2.3非等溫同步糖化發(fā)酵

非等溫同步糖化發(fā)酵(NSSF)工藝包含一個水解塔和一個發(fā)酵罐，水解和發(fā)酵分別在水解塔和發(fā)酵罐中進行，不含酵母細胞的流體在兩者之間循環(huán)。NSSF作為同步糖化發(fā)酵的一種改良方法，在一定程度上解決了纖維素酶和發(fā)酵菌體最適溫度不同的問題，使水解階段和發(fā)酵階段各自保持在最適宜的溫度，在保持酶和酵母活性的同時提高水解效率和乙醇產(chǎn)率。Wu等[31]將酶解和發(fā)酵在2個不同的反應(yīng)器中同時進行，研究表明，NSSF工藝的水解與發(fā)酵條件更加穩(wěn)定，酶解效果明顯提高，酶的需求量減少30 %～40 %。Chen等[32]在蒸汽爆破的最佳預(yù)處理條件下預(yù)處理玉米秸稈5 min，預(yù)處理后樣品的酶解糖化和發(fā)酵分別在約50和37 ℃下進行，酶解糖化的葡萄糖被酵母消耗，并通過與吸附活性炭偶聯(lián)的CO2氣提分離得到乙醇，底物質(zhì)量分數(shù)達到25 %時，在發(fā)酵中獲得的乙醇產(chǎn)率為18.96 %～30.29 %。Alamanou等[33]利用廚余垃圾在質(zhì)量分數(shù)20 %條件下，121 ℃微波消化15 min，加入7 FPU/g的纖維素酶和Novozyme 188混合酶(體積比5∶1)，50 ℃酶解6 h，利用S.cerevisiae在30 ℃發(fā)酵36 h，最終底物質(zhì)量分數(shù)為40 %時，乙醇產(chǎn)量為42.66 g/L。Oh等[34]使用數(shù)學(xué)模型和計算機模擬軟件包估算每個溫度下的動力學(xué)參數(shù)，并繪制出可獲得最大乙醇產(chǎn)量的溫度曲線。將純化的纖維素，在pH值4.8的檸檬酸鈉緩沖液中攪拌12 h，用里氏木霉(Trichodermareesei)纖維素酶Celluclast 1.5 L和β-葡萄糖苷酶(Novozyme 188)進行酶解，加酶量為30 FPU/g。研究發(fā)現(xiàn)，酶解最佳溫度分布為35 ℃開始，有利于里氏木霉細胞的繁殖，10 h后，操作溫度迅速升至39 ℃，然后緩慢降至36 ℃。在具有上述溫度分布的NSSF系統(tǒng)中，獲得的最大乙醇產(chǎn)量為14.87 g/L。

3 酶制備、酶解糖化與發(fā)酵“一鍋法”

聯(lián)合生物(CBP)工藝也被稱作直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)，即在一個反應(yīng)容器中、用一種微生物或者一個微生物群完成木質(zhì)纖維原料的酶制備、酶水解以及戊糖和己糖的發(fā)酵全過程。該工藝的優(yōu)點是流程簡單、操作方便，適合應(yīng)用于大規(guī)模的生產(chǎn)；缺點是篩選在各個反應(yīng)步驟都有高效轉(zhuǎn)化率的菌株或菌株群比較困難，導(dǎo)致目前大部分生產(chǎn)過程中底物的轉(zhuǎn)化率和乙醇的產(chǎn)率都比較低，特別是在高底物濃度的條件下。Li等[35]采用CBP工藝，使用木薯漿制備生物乙醇，熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)和嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacteriumaotearoense)聯(lián)用可產(chǎn)生13.65±0.45 g/L的葡萄糖，高溫發(fā)酵84 h后，可產(chǎn)生8.83±0.31 g/L的乙醇，乙醇轉(zhuǎn)化率為(64.95±2.71)%。楊梅等[36]在聯(lián)合生物加工技術(shù)發(fā)酵菊芋生料生產(chǎn)乙醇工藝中，利用馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)，在最佳工藝條件下，分別在發(fā)酵12和24 h時補料，菊芋干粉終質(zhì)量濃度可達到300 g/L，發(fā)酵時間48 h，乙醇質(zhì)量濃度達到91.6 g/L，乙醇對糖的得率為0.464，為理論值的90.6 %。Gao等[37]通過聯(lián)合生物工藝應(yīng)用氧化還原電位提高菊粉的乙醇產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)，當氧化還原電位控制在-130 mV時，達到最高的乙醇質(zhì)量濃度和生產(chǎn)率，分別為97.7 g/L和2.04 g/(L·h)，殘余糖質(zhì)量濃度為3 g/L。Yang等[38]為了提高釀酒酵母的纖維素酶表達效率，通過原生質(zhì)體法將含有單酶系統(tǒng)的三纖維素酶基因(sestc)的真核表達載體整合到釀酒酵母基因組中。使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)篩選和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，選擇了能夠有效表達異質(zhì)纖維素酶的幾種重組釀酒酵母菌株。重組釀酒酵母轉(zhuǎn)化體的纖維素酶、內(nèi)切-β-D-葡聚糖酶、外切-β-D-葡聚糖酶和木聚糖酶的總活性分別為1.1、378、1.44和164 U/mL，比野生型菌株高27.5、63、24和19倍。以麥麩為碳源，重組釀酒酵母菌株產(chǎn)生的乙醇質(zhì)量濃度為8.1 g/L，比野生型菌株產(chǎn)生的質(zhì)量濃度(0.14 g/L)高57.86倍。

4 預(yù)處理、酶解糖化與發(fā)酵“一鍋法”

現(xiàn)在大多數(shù)的木質(zhì)纖維原料預(yù)處理后需要經(jīng)過固液分離、水洗、中和和解毒等過程，使得實驗成本增加，因此，建立一種低成本、高效的生物乙醇制備工藝，需要盡可能省去預(yù)處理后的一些環(huán)節(jié)。預(yù)處理、酶解糖化和發(fā)酵“一鍋法”可以滿足以上要求。如圖2所示，預(yù)處理、酶解糖化和發(fā)酵“一鍋法”是指預(yù)處理、酶解糖化與發(fā)酵過程在同一反應(yīng)器中進行，省去了預(yù)處理后固液分離和水洗等過程。為了避免預(yù)處理后抑制劑的產(chǎn)生，預(yù)處理過程中不能使用大量的酸和催化劑。預(yù)處理、酶解糖化和發(fā)酵“一鍋法”從經(jīng)濟的角度看具有明顯的優(yōu)勢。然而，此工藝面臨很多挑戰(zhàn)，比如：1)由于水的限制，質(zhì)量傳遞限制存在于預(yù)處理、酶解糖化與發(fā)酵過程的始終；2)高的底物濃度會產(chǎn)生抑制劑，從而影響后續(xù)過程[39]，葡糖糖和纖維二糖等終產(chǎn)物的濃度會降低整體酶活性[40]；3)高的葡萄糖和木糖等碳源濃度會降低微生物活性[41]。Jung等[42]以稻草為原料采用預(yù)處理、酶解糖化與發(fā)酵“一鍋法”制備生物乙醇。稻草原料在催化劑混合液中，經(jīng)過3 min溫度上升至190 ℃，在190 ℃條件下預(yù)處理2 min。預(yù)處理后的稻稈采用SSF工藝進行發(fā)酵，底物質(zhì)量分數(shù)為6 %，加入纖維素酶的量為15 FPU/g，釀酒酵母接種量為5 %，發(fā)酵60 h后，乙醇的產(chǎn)率為理論值的70.7 %。結(jié)果表明，預(yù)處理、酶解糖化與發(fā)酵“一鍋法”是制備生物乙醇的一種經(jīng)濟有效的方法。Xu等[43]使用離子液體[Ch][OAc]預(yù)處理玉米秸稈，液固比為10∶3，140 ℃預(yù)處理3 h。預(yù)處理后，加入纖維素酶Cellic?CTec2和HTec2，每克葡聚糖加入20 mg酶，50 ℃酶解24 h。研究發(fā)現(xiàn)，使用預(yù)處理、酶解糖化與發(fā)酵“一鍋法”工藝，離子液體的使用量降低了90 %，加水量和廢水減少了85 %，乙醇產(chǎn)量為41.1 g/L,相當于總葡萄糖的74.8 %。

圖 2 預(yù)處理、酶解糖化與發(fā)酵“一鍋法”流程圖Fig. 2 “One-pot” flow chart of pretreatment, enzymatic saccharification and fermentation

5 結(jié)語與展望

在全球性能源危機環(huán)境下，利用木質(zhì)纖維制備生物乙醇，不僅能夠緩解能源危機，而且解決了丟棄木質(zhì)纖維造成的環(huán)境污染和資源浪費等問題。傳統(tǒng)的“分步法”制備生物乙醇面臨著產(chǎn)量低、產(chǎn)生大量廢水以及廢棄物難以處理等問題，因此，“一鍋法”制備生物乙醇日益受到人們的關(guān)注。然而，發(fā)展經(jīng)濟有效的“一鍋法”制備生物乙醇的方法仍然面臨很多挑戰(zhàn)，如水解最適溫度和發(fā)酵最適溫度不一致、發(fā)酵過程產(chǎn)生的乙醇會抑制纖維素酶的活性以及酵母菌的生長繁殖和廢棄物難以回收利用等。開發(fā)新型的“一鍋法”制備生物乙醇以提高乙醇產(chǎn)量、減少水資源浪費、避免產(chǎn)生二次污染，對木質(zhì)纖維資源化利用有著十分重要的意義。

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