謝川東 文燕 曾昱偉 王星 高盼奇 陳紅英

摘要：為探究黃連（Coptis chinensis Franch.）抗菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌進(jìn)行抗菌活性測(cè)試，對(duì)黃連不同的溶劑提取物、組分、化合物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，黃連對(duì)兩種菌均有一定的抗菌活性，不同試驗(yàn)樣品對(duì)兩種菌的抑菌趨勢(shì)一致，在同一試驗(yàn)濃度下，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性明顯強(qiáng)于大腸桿菌。具體表現(xiàn)為100%醇提物>50%醇提物>水提物;不同組分中，總堿的抗菌活性最強(qiáng)，而總堿和多糖顯示微弱的抗菌活性;對(duì)總堿進(jìn)一步分離得到4個(gè)生物堿（小檗堿、黃連堿、巴馬亭、表小檗堿），其中小檗堿和黃連堿對(duì)兩種試驗(yàn)菌的活性最強(qiáng)，但在同一濃度下，小檗堿活性弱于總堿。黃連抗菌活性成分主要來(lái)源于生物堿部分，不同成分之間可能存在協(xié)同抗菌關(guān)系。

關(guān)鍵詞：黃連（Coptis chinensis Franch.）;小檗堿;組分;生物堿;抗菌

中圖分類(lèi)號(hào)：R282? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）23-0085-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.019? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

由于人類(lèi)在抗炎癥疾病和農(nóng)漁牧業(yè)養(yǎng)殖中不合理使用抗生素，導(dǎo)致耐藥菌株不斷增加。目前，臨床上可供選擇的抗菌素越來(lái)越少。在人類(lèi)與疾病的抗?fàn)幨分?，中草藥用于炎癥的治療有明確記載。從中草藥中發(fā)現(xiàn)新的抗菌藥成為很多醫(yī)藥學(xué)者研究的目標(biāo)。

黃連，為毛茛科植物黃連（Coptis chinensis Franch.）的干燥根莖。因其根莖呈連珠狀而色黃，所以稱(chēng)之為黃連，是一種臨床常用的抗菌抗病毒中藥。黃連抗菌譜很廣，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌、各型流感病毒及真菌類(lèi)均有一定的抑制作用[1]，其主要成分為異喹啉生物堿，其中小檗堿含量較高。小檗堿又名黃連素，有良好的抗菌效果。有研究報(bào)道，黃連對(duì)幽門(mén)螺桿菌的體外抗菌活性?xún)?yōu)于小檗堿[2]。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃連降糖、抗氧化活性均優(yōu)于小檗堿[3，4]。為探討小檗堿以外的黃連抗菌成分，本試驗(yàn)以革蘭氏陰性菌大腸桿菌（Escherichia coil）和革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為指示菌，對(duì)黃連不同極性的組分進(jìn)行抗菌活性跟蹤，以期為這方面研究提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

黃連購(gòu)于四川省天府神龍中藥飲片有限公司。菌種金黃葡萄球菌和大腸桿菌由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院菌種儲(chǔ)藏室提供。

紫外分光光度計(jì)（UV2400型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）;高速逆流色譜（TBE-300B型，上海同田生化有限公司）;微量分析天平（TP-214型，美國(guó)丹佛儀器有限公司）;超聲清洗機(jī)（KQ32002型，昆山市超聲儀器有限公司）;高壓滅菌鍋（MLS-3780型，日本三洋公司）;恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162型，上海齊欣科學(xué)儀器公司）;超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

小檗堿、巴馬亭、黃連堿、表小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度均大于98%。鏈霉素和紅霉素藥敏紙片購(gòu)于北京普納德科技有限公司，其余試劑均為分析純。

1.2? 方法

1.2.1? 不同溶劑的提取? 精密稱(chēng)取適量過(guò)篩的黃連粗粉100 g 3份，分別用適量的水、50%乙醇、無(wú)水乙醇在70 ℃下超聲提取1 h，再用相應(yīng)的溶劑配成1 g/mL的藥劑。

1.2.2? 黃連不同組分的制備

1）提取流程：黃連粉碎過(guò)篩后，取黃連粗粉適量，按照以下工藝流程分別制備極性不同的黃連組分，如圖1所示。經(jīng)過(guò)不同流程，黃連粗提物被分為黃連總堿、非生物堿、多糖3個(gè)部分。

2）多糖的提取與分析

多糖的提?。壕芊Q(chēng)取粉碎至20目的黃連粗粉100 g，置于索氏提取器中，用3倍超純水回流脫脂6 h。按照參考文獻(xiàn)[5]的方法提取制備黃連多糖。

定性分析：Molish試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。如樣品含有糖類(lèi)成分，將在液面交界處很快出現(xiàn)紫紅色環(huán)。搖勻后顏色變深，冷卻后加水稀釋會(huì)出現(xiàn)暗紫色沉淀。

定量分析：參看文獻(xiàn)[6]苯酚-硫酸法測(cè)定總糖的含量。平行測(cè)定3次取平均值。

3）黃連中總堿和非生物堿的提?。喊凑丈鲜龉に嚵鞒?，參照文獻(xiàn)[7]的方法，提取制得黃連非生物堿，參照文獻(xiàn)[8]的方法得到黃連總堿。

1.2.3? 抗菌活性試驗(yàn)

1）藥液制備：精密稱(chēng)取黃連分離得到的不同組分，用少許去離子水超聲溶解，分別配成1、2、5? ?mg/mL的濃度。不同溶劑的黃連提取物均為1 g/mL的生藥濃度。

2）含藥紙片的制備：取一定數(shù)量的濾紙片（直徑6 mm），分別加入上述制備的不同濃度藥液，完全浸泡紙片2.0 h，吹干，高溫滅菌30 min，取出放在紫外通風(fēng)櫥中吹干備用。用相同的溶劑浸泡紙片同法操作，作為陰性對(duì)照。

3）菌懸液的制備：取活化好的大腸桿菌和金黃葡萄球菌的平板洗滌，通過(guò)麥?zhǔn)媳葷岷惋@微鏡計(jì)數(shù)的方法配成1.0×108 cuf/mL菌懸液備用。

4）濾紙片法：準(zhǔn)確吸取菌液0.1 mL均勻涂布于瓊脂平板培養(yǎng)基的全部表面，用滅菌鑷子將制備好的濾紙片貼于瓊脂平板表面，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)菌種重復(fù)3次，求均值。

1.3? 色譜分離

對(duì)抗菌活性最強(qiáng)的總堿組分，采用高速逆流色譜法（HSCCC）進(jìn)行分離純化。以氯仿∶甲醇∶0.2 mol/L鹽酸（2∶1∶1）的比例配置溶劑體系，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。精密稱(chēng)取適量總堿，用流動(dòng)相溶解配置成20 mL溶液。參照文獻(xiàn)方法[3]，溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速850 r/min，流速2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，待兩相體系達(dá)到平衡后，將樣品溶液注入主機(jī)中，根據(jù)色譜工作站圖譜收集各色譜峰。

各色譜峰的定性與定量按照中國(guó)藥典（2015版）用TLC法和HPLC法的相同條件進(jìn)行。

1.4? MIC測(cè)定

將上述色譜分離制得的色譜峰溶液減壓濃縮至干后，配成4.00 mg/mL的藥液。參照文獻(xiàn)方法[9]，按倍比稀釋法，用肉湯液體培養(yǎng)基將藥液分別稀釋為10個(gè)濃度：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，? ?1∶256，1∶512，1∶102 4。試驗(yàn)用試管分別加入液體培養(yǎng)基100 μL，試驗(yàn)菌液20 μL，藥液120 μL，混勻后，置于37 ℃培養(yǎng)24 h。肉眼觀察每支試管的澄清度。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同溶劑提取物抗菌活性

當(dāng)黃連提取物濃度為1 g/mL時(shí)，不同溶劑提取物對(duì)2種試驗(yàn)菌均有抑菌效果，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性明顯優(yōu)于大腸桿菌，具體結(jié)果見(jiàn)表1。不同溶劑提取物分別對(duì)2種菌的抑制趨勢(shì)一致，其活性強(qiáng)弱從大到小均為100%醇提物>50%醇提物>水提物。水提物對(duì)大腸桿菌沒(méi)有抗菌活性。

不同溶劑提取黃連，提取的成分明顯不同。根據(jù)性相近則相容的原則，水提物含有多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、多酚、生物堿、木質(zhì)素等成分，而無(wú)水乙醇提取物中，多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)幾乎未被提出，主要是小分子有機(jī)物，含水醇提物的成分介于二者之間。從上述結(jié)果看，對(duì)2種試驗(yàn)菌有抑菌活性的主要是小分子的有機(jī)物。為進(jìn)一步了解黃連抗菌活性成分，用化學(xué)方法把黃連分成不同極性組分。

2.2? 黃連組分提取分離結(jié)果

將黃連按照試驗(yàn)流程分成3個(gè)組分：多糖、非生物堿、總堿。多糖為大分子，生物堿為黃連的主要組分，非生物堿是除掉兩者以后的其余部分。從100 g黃連粉末中，按照工藝流程得到3.15 g黃連總堿，1.23 g非生物堿，0.51 g多糖。多糖的定性試驗(yàn)顯示有明顯的紫色環(huán)。葡萄糖對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)方程為y=12.24x+0.067 6，r2=0.999， 其中y代表吸光度，x代表葡萄糖濃度（mg/mL）。粗多糖中多糖的含量為29.31%。

2.3? 組分抑菌活性結(jié)果與分析

3種組分總堿、非生物堿、多糖的試驗(yàn)濃度均為5 mg/mL，用總堿、非生物堿、多糖制作的藥敏紙片載藥量為50 μg/片，組分抑菌活性結(jié)果見(jiàn)下表2。從表2可以看出，在試驗(yàn)濃度下，黃連多糖和非生物堿對(duì)2種試驗(yàn)菌都不敏感，而黃連總堿的抗菌活性較為明顯，對(duì)2種菌表現(xiàn)高度的敏感。非生物堿和多糖的表現(xiàn)較弱，這與前面水提物的活性不如醇提物的活性結(jié)果一致，黃連抗菌活性主要貢獻(xiàn)來(lái)源于總堿。普遍認(rèn)為，黃連主要成分小檗堿對(duì)痢疾桿菌、炭疽桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌以及腦膜炎雙球菌等均有較強(qiáng)抑制作用[10]。從上述結(jié)果看，在同樣試驗(yàn)條件下，小檗堿對(duì)2種試驗(yàn)菌的活性明顯弱于黃連總堿，這說(shuō)明黃連總堿中還有其他成分與小檗堿協(xié)同起抗菌作用。

2.4? 總堿分離結(jié)果

黃連總堿通過(guò)高速逆流色譜儀進(jìn)行液液色譜分離，無(wú)損分離純化，按照餾出峰進(jìn)行收集。色譜分離結(jié)果見(jiàn)圖2。共收集4個(gè)色譜峰的黃色溶液，分別濃縮重結(jié)晶后，經(jīng)TLC和HPLC分析，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，4個(gè)色譜峰分別為巴馬亭、小檗堿、表小檗堿和黃連堿，純度均大于96%，結(jié)果與文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致。這4個(gè)化合物均為黃連的生物堿，在中國(guó)藥典中為黃連質(zhì)控的主要指標(biāo)成分，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3。

在色譜分離過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，溶劑體系的pH對(duì)色譜的出峰時(shí)間有很大影響。當(dāng)體系pH由3變?yōu)?時(shí)，出峰時(shí)間可以減少2.0 h左右，而分離度變化不大。

2.5? 4種生物堿的抑菌結(jié)果

4種生物堿均有抑菌效果，它們的最小抑菌濃度測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。抑制金黃色葡萄球菌的活性大小順序?yàn)闉樾￠迚A、黃連堿>巴馬亭、表小檗堿;抑制大腸桿菌的活性大小順序?yàn)辄S連堿>小檗堿>表小檗堿>巴馬亭，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11]。巴馬亭、小檗堿、表小檗堿、黃連堿4種生物堿均為異喹啉生物堿，分子量分別為352、336、336、320 g/moL，分子量大小相似，不同的是結(jié)構(gòu)差異。對(duì)這2種試驗(yàn)菌而言，可能亞甲氧基不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，2，3位碳上亞甲氧基（R1+R2）的影響強(qiáng)于9，10位碳上的亞甲氧基（R3+R4）。從上述組分抑菌活性結(jié)果看，這4種組分彼此可能有協(xié)同抑菌的效果，也有可能這4種生物堿之外的微量組分有較強(qiáng)的抑菌活性。試驗(yàn)中也對(duì)黃連總堿HSCCC分離4種生物堿以外的餾分進(jìn)行活性測(cè)試，但結(jié)果較弱。

3? 小結(jié)與討論

黃連對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效果強(qiáng)于革蘭氏陰性菌大腸桿菌，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致。當(dāng)用不同溶劑提取時(shí)，黃連對(duì)2種試驗(yàn)菌的抑菌活性大小順序?yàn)榇继嵛?50%醇提物>水提物;把黃連分成非生物堿、多糖、總堿時(shí)，發(fā)現(xiàn)這3種組分均有抑菌活性，其中總堿的抑菌活性最強(qiáng)，多糖的抗菌活性較弱。進(jìn)一步將總堿分離得到4種主要生物堿，其中小檗堿和黃連堿對(duì)2種試驗(yàn)菌的活性較強(qiáng)，并且4種主要生物堿之間可能存在協(xié)同抗菌關(guān)系。

黃連有抗菌活性，不同溶劑提取物抗菌活性不同，這也說(shuō)明黃連用不同炮制方法時(shí)，其抗菌活性也不同。黃連對(duì)多種細(xì)菌均有抗菌作用，但細(xì)菌不同，其抗菌成分有差異，說(shuō)明不同成分作用于細(xì)菌的機(jī)理時(shí)不一樣，但這都是體外試驗(yàn)。中藥體內(nèi)抗菌機(jī)理是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，涉及很多微生物及受生物體內(nèi)環(huán)境的影響?，F(xiàn)在研究認(rèn)為，中藥抗菌是對(duì)細(xì)菌、對(duì)機(jī)體多環(huán)節(jié)多途徑作用的綜合結(jié)果。少數(shù)中藥抗菌與其有效成分直接作用于菌體有關(guān)，而大多數(shù)中藥抗菌機(jī)理是激發(fā)生物體內(nèi)在的其他抗菌因素，以及降低細(xì)菌毒力或者減輕細(xì)菌對(duì)組織細(xì)胞的破壞作用等途徑起到抗菌作用。

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