趙娜娜，劉 匯，孫道磊，王 會(huì)，張 輝*，孫佳明*

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.吉林省延邊朝鮮族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 延吉 133002；3. 云南白藥集團(tuán)中藥資源有限公司，昆明 650100；4.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

核桃楸為胡桃科胡桃屬植物核桃楸（ Juglans Mandshurica Maxim.），又名胡桃楸，落葉喬木，分布于中國(guó)東北、華北、河北等地區(qū)，河南、山東有散生，其種子、青果、樹皮均可入藥。核桃楸樹皮及葉具有消熱解毒抗癌作用[1-5]。用胡桃皮、胡桃枝作為抗癌民間驗(yàn)方，歷史悠久。核桃肉還是重要的滋補(bǔ)中藥，可治慢性闌尾炎、高血壓、腰腿酸痛、止咳消腫等[6]。據(jù)報(bào)道[7-11]，核桃楸的不同藥用部位中含有黃酮醇、醌、甾醇和多酚復(fù)合物等多種類型化學(xué)成分，并對(duì)清除自由基、抗病毒、抗腫瘤、抗菌殺蟲等具有良好的效果。據(jù)報(bào)道[12]，核桃楸總黃酮能夠有效清除DPPH自由基，具有較強(qiáng)的抗氧化作用。DPPH是一種比較穩(wěn)定的自由基，作為一種常用篩選抗氧化藥物的試劑，在國(guó)外已被廣泛使用。DPPH法依據(jù)在517 nm處有最大吸收，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因此加入抗氧化劑后，以分光光度法測(cè)定其在517 nm處吸收值的下降值，即可看出抗氧化劑對(duì)DPPH的清除能力[13]。本文通過DPPH自由基清除模型[14]，研究核桃楸不同藥用部位乙醇提取物對(duì)DPPH自由基清除活性，篩選核桃楸抗氧化有效藥用部位，為其抗氧化藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 核桃楸葉、樹皮、根皮及果皮采于吉林省通化市，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為胡桃科胡桃屬植物核桃楸（Juglans Mandshurica Maxim.）的樹葉、樹皮、根皮及果皮。

1.2 試劑與儀器 DPPH 、維生素E和維生素C（sigma公司），其余試劑均為分析純。酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；96微孔板，各型號(hào)移液槍及槍頭等。

2 方法與結(jié)果

2.1 核桃楸各藥用部位乙醇提取物的制備 稱取核桃楸葉、樹皮、根皮、果皮各10 g（40目篩）分別置于圓底燒瓶中，18倍量95%乙醇回流提取2次，1 h/次，合并提取液，過濾，減壓低溫濃縮至稠膏。分別取核桃楸葉、樹皮、根皮、果皮乙醇提取物適量，10 mL甲醇溶解，作為供試藥物。

2.2 核桃楸各藥用部位乙醇提取物對(duì)DPPH自由基清除活性的測(cè)定 運(yùn)用DPPH法[15-16]，對(duì)核桃楸各藥用部位乙醇提取物進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)價(jià)。精密量取濃度為26.4 mg/L的DPPH甲醇溶液 2 mL，再分別加入2 mL以甲醇為溶劑已配制好的不同濃度的樣品液中，充分混勻，避光條件下反應(yīng)30 min，在517 nm測(cè)定其吸光度。同時(shí)以2 mL甲醇溶液代替樣品溶液作為空白對(duì)照A0，以樣品溶液2 mL與2 mL甲醇溶液混合作為樣品對(duì)照Aj ，并以維生素E和維生素C作為陽性對(duì)照，以樣品液對(duì)DPPH溶液清除率Y可由該公式計(jì)算：Y=[1-（Ai-Aj）/A0] ×100%，其中，Ai 代表DPPH溶液與待測(cè)溶液混合后的吸光度；Aj 代表溶劑和待測(cè)溶液混合后的吸光度；A0 代表溶劑和DPPH溶液混合后的吸光度。

2.2.1 維生素C、維生素E對(duì)DPPH清除能力測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，維生素C、維生素E均具有一定的清除自由基活性能力，且隨著提取物濃度增加，清除率逐漸增高，但隨著濃度增加到一定值后，清除率趨于平緩。維生素C在其濃度為0.816～4.080 μg/mL范圍內(nèi)，抗氧化劑濃度與DPPH清除率之間基本呈線性關(guān)系，經(jīng)回歸得方程：Y=14.792X-0.652，r2= 0.997 1，其中：Y為DPPH清除率，X為維生素C的濃度。維生素E在其濃度為2.944～14.720 μg/mL范圍內(nèi)，抗氧化劑濃度與DPPH清除率之間基本呈線性關(guān)系，經(jīng)回歸得方程：Y = 4.0452X-3.157，r2= 0.998 9，其中：Y為DPPH清除率，X為維生素E的濃度。

2.2.2 核桃楸葉、樹皮、根皮、果皮對(duì)DPPH清除能力測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)測(cè)定的范圍內(nèi)，核桃楸葉各萃取部位均具有一定的清除自由基活性的能力，且隨著提取物濃度增加，清除率逐漸增高，但隨著濃度增加到一定值后，清除率趨于平緩。核桃楸葉其濃度在6.080～18.231 μg/mL范圍內(nèi)，抗氧化劑濃度與DPPH清除率之間基本呈線性關(guān)系，經(jīng)回歸得方程：Y = 2.831 8X-0.005 9，r2= 0.999 7，其中：Y為DPPH清除率，X為抗氧化劑質(zhì)量濃度；樹皮其濃度在0.890～7.150 μg/mL范圍內(nèi)，抗氧化劑濃度與DPPH清除率之間基本呈線性關(guān)系，經(jīng)回歸得方程：Y = 5.887 1X-2.656 8，r2= 0.998 7，其中：Y為DPPH清除率，X為抗氧化劑質(zhì)量濃度；根皮濃度在1.110～8.862 μg/mL范圍內(nèi)，抗氧化劑濃度與DPPH清除率之間基本呈線性關(guān)系，經(jīng)回歸得方程：Y = 5.471X-6.488，r2= 0.999，其中：Y為DPPH清除率，X為抗氧化劑質(zhì)量濃度；果皮濃度在9.110～27.320 μg/mL范圍內(nèi)，抗氧化劑濃度與DPPH清除率之間基本呈線性關(guān)系，經(jīng)回歸得方程：Y = 1.762 1 X+2.065 4，r2= 0.997 4，其中：Y為DPPH清除率，X為抗氧化劑質(zhì)量濃度。

核桃楸各藥用部位乙醇提取物的DPPH清除率見表1，結(jié)果可見，核桃楸樹皮、根皮活性對(duì)DPPH自由基清除活性均較好，且抑制率強(qiáng)于維生素E而弱于維生素C，而核桃楸葉、核桃楸果皮活性稍弱，表明核桃楸樹皮、根皮系抗氧化有效藥用部位。

表1 核桃楸各藥用部位乙醇提取物的DPPH自由基清除活性

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，核桃楸樹皮、根皮清除DPPH自由基的IC50均低于10 μg/mL，二者活性強(qiáng)于維生素E而弱于維生素C，說明二者具有很強(qiáng)的抗氧化活性，為核桃楸抗氧化的有效藥用部位。但如果針對(duì)核桃楸樹皮及根皮開發(fā)應(yīng)用將嚴(yán)重影響生態(tài)破壞及資源的可持續(xù)利用。而核桃楸葉也具有較好的抗氧化活性，富含豐富的黃酮類成分。而黃酮類成分不僅通過自身具有的酚羥基而發(fā)揮自由基清除作用[17]，而且還具有其他多種生物活性。不同類型的黃酮類成分通過抑制α-葡萄糖苷酶而發(fā)揮降血糖作用；抗輻射的作用機(jī)制與其對(duì)造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的保護(hù)、對(duì)活性氧自由基的清除和對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制以及對(duì)DNA損傷的防護(hù)等作用有關(guān)；通過抑制神經(jīng)氨酸酶發(fā)揮抗病毒活性，通過降血脂、降壓及抗氧化等藥理作用，有利于促進(jìn)心腦血管疾病的康復(fù)；通過調(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)功能而抗焦慮[18-22]。尤其是在抗腫瘤方面，黃酮類成分也體現(xiàn)出獨(dú)特的活性，這從另一方面闡明了核桃楸不同藥用部位具有的抗腫瘤活性不僅源于樹皮、果皮中的胡桃醌及其衍生物，而且也源于核桃楸葉中富含的黃酮類成分[23-24]。同時(shí)核桃楸葉是一種可持續(xù)再生資源，可以為天然抗氧化劑的新來源，并有潛力針對(duì)多種疾病進(jìn)行深度開發(fā)。因此，核桃楸葉能夠作為核桃楸新的藥用部位，在新的應(yīng)用方向上進(jìn)行可持續(xù)利用研究。

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