吳 萍，高 嵩*，徐 建，鄭廣晶，李亞東，崔憲利

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司 吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130103；2.吉林長(zhǎng)白山藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，吉林 白山 134300）

精芪雙參膠囊由人參、黃芪、丹參、黃精4味中藥組成，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、活血化瘀、養(yǎng)心安神等功效?，F(xiàn)執(zhí)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-5136（B-0136）-2014Z[1]。標(biāo)準(zhǔn)中收載丹參酮IIA、人參薄層色譜鑒別項(xiàng)及黃芪甲苷含量測(cè)定項(xiàng)，人參薄層鑒別方法重現(xiàn)性差，缺少君藥丹參含量測(cè)定指標(biāo)。故本文對(duì)人參薄層鑒別方法進(jìn)行了改進(jìn)，并建立方中君藥丹參的高效液相含量測(cè)定方法，從而更加全面、準(zhǔn)確的控制產(chǎn)品質(zhì)量[2-3]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimae-3000雙三元梯度液相色譜（美國(guó)戴安公司）、SLD-1型薄層色譜攝影儀（天津思利達(dá)色譜技術(shù)開發(fā)公司）、AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多公司）、KQ-300DE超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑、試藥 樣品來源：吉林長(zhǎng)白山藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；對(duì)照品來源：人參皂苷Rg1（批號(hào)：110703-200424）、人參皂苷Re（批號(hào)：110754-201123）、人參皂苷Rb1（批號(hào)：110704-201424） 、人參對(duì)照藥材（批號(hào)：120917-201110）、丹酚酸B（批號(hào)111562-201514）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、磷酸為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 人參薄層色譜鑒別方法的改進(jìn)

2.1 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物2.5 g，加水30 mL，攪拌均勻，超聲處理20 min，離心，取上清液，用三氯甲烷提取2次（輕搖），20 mL/次，棄去三氯甲烷液，水層以水飽和的正丁醇提取2次，30 mL/次，合并正丁醇液，再以正丁醇飽和的氨試液洗2次，60 mL/次，分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2 陰性樣品溶液制備 按精芪雙參膠囊工藝和處方比例，制備缺人參的陰性樣品，按2.1項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 對(duì)照藥材溶液制備 取人參對(duì)照藥材0.5 g，按2.1項(xiàng)下方法制成對(duì)照藥材溶液。

2.4 對(duì)照品溶液制備 取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.5 展開及顯色條件

2.5.1 原方法 吸取上述4種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13 : 7 : 2）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，置冰箱冷藏層展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光下檢視。結(jié)果：供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，但人參皂苷Rg1與黃芪甲苷色譜斑點(diǎn)分離效果較差[4-7]。

2.5.2 改進(jìn)的方法 吸取上述4種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水（10 : 4 : 5 : 2 : 2）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在90 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光下檢視。結(jié)果：供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，各斑點(diǎn)分離效果較好，方法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好[8-9]。

2.6 耐用性試驗(yàn) 取1批樣品進(jìn)行耐用性試驗(yàn)。其中包括：1）不同廠家薄層板的考察；2）溫度考察；3）濕度考察；4）點(diǎn)樣方式考察。具體試驗(yàn)條件見表1。結(jié)果：人參薄層鑒別方法耐用性較好。

表1 薄層鑒別耐用性試驗(yàn)條件

3 丹酚酸B含量測(cè)定

3.1 色譜條件 建立色譜柱為Hypecsil ODS C18柱（4. 6 mm ×250 mm，5 μm）；以甲醇-0.2%磷酸溶液（40 : 60）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm；理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

3.2 對(duì)照品溶液制備 取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL含0.10 mg的溶液，即得。3.3 供試品溶液制備 取裝量差異項(xiàng)下本品內(nèi)容物，混勻，取約0.1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加70%甲醇約20 mL，密塞，超聲處理（功率400 W，頻率為50 kHz）20 min，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 線性關(guān)系的考察 取丹酚酸B對(duì)照品溶液（0.10 mg/mL），分別精密吸取2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，繪制丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果：回歸方程為Y = 1.987 7X-2.448，相關(guān)系數(shù)r值為1，說明丹酚酸B在0.2～2.0 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系[10-11]。

3.5 專屬性試驗(yàn) 按精芪雙參膠囊工藝和處方比例，制備缺丹參的陰性樣品，同法測(cè)定丹酚酸B對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品的HPLC色譜圖。結(jié)果：在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，供試品溶液與其他組分分離度良好，陰性對(duì)照無干擾。

3.6 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一丹酚酸B對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)注入液相色譜儀6次, 按上述色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果：丹酚酸B相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為0.18% ，表明儀器精密度較好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、4、8、12、24 h測(cè)定1次，記錄丹酚酸B峰面積，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果：丹酚酸B峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.66%，表明供試品溶液中丹酚酸B在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品內(nèi)容物適量，取約0.1 g，精密稱定，共6份，按上述色譜條件測(cè)定其含量。結(jié)果：樣品中丹酚酸B平均含量為2.11 mg/粒，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.88 %，表明方法重復(fù)性較好。

3.9 回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品（丹酚酸B含量2.11 mg/g），取約 0.05 g，6份，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，精密量取丹酚酸B對(duì)照品溶液（0.105 5 mg/mL） 1 mL，6份，分別加入上述容量瓶中，按供試品溶液制備方法操作，制得回收率試驗(yàn)供試品溶液。按正文含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果：平均回收率為99.60%，RSD為0.56%。表明本方法準(zhǔn)確度良好。

3.10 耐用性試驗(yàn) 分別考察流動(dòng)相流速的變化、流動(dòng)相比例的變化以及采用不同品牌的色譜柱對(duì)同一批樣品含量測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果：在上述條件下測(cè)得同一批樣品中丹酚酸B含量RSD值＜2%。色譜條件在一定范圍內(nèi)變化對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小，表明方法耐用性良好。

3.11 10批樣品含量測(cè)定 按建立含量測(cè)定方法分別測(cè)定不同批次精芪雙參膠囊中丹酚酸B含量，結(jié)果：10批樣品每粒含丹參以丹酚酸B計(jì)均在1.7 mg以上，根據(jù)10批樣品的測(cè)定結(jié)果，按平均含量80%計(jì)，制定含量限度范圍為本品每粒含丹參以丹酚酸B（C36H30O16）計(jì)，不得少于1.5 mg。

4 討論

由于精芪雙參膠囊中人參所含成分復(fù)雜且與黃芪所含成分極性相近，薄層鑒別方法所用展開系統(tǒng)也基本相同，普通硅膠G板無法將兩者分離。而選擇高效硅膠G板時(shí)，各成分間分離效果較好。

分別采用1）三氯甲烷-甲醇-水（13 : 7 : 2）10 ℃以下放置的下層溶液；2）三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15 : 40 : 22 : 10）10 ℃以下放置的下層溶液；3）三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水（5 : 2 : 3 :1 : 1）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果：以展開劑2）和3）進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，均能將人參皂苷Rg1與干擾成分分離，展開劑3）分離效果最佳。

精芪雙參膠囊方中君藥丹參的水溶性酚酸類成份具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、養(yǎng)心安神的功效，其代表成分為丹酚酸B，故本文建立丹酚酸B含量測(cè)定方法，更全面的監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量。丹酚酸B在檢測(cè)過程中易發(fā)生分解，因此分別重點(diǎn)考察不同柱溫及不同濃度磷酸溶液為流動(dòng)相對(duì)丹酚酸B含量的影響，結(jié)果柱溫在25 ℃以上丹酚酸B的含量隨溫度升高逐漸降低，且分離效果也逐漸降低；流動(dòng)相體系中磷酸溶液濃度為0.1%（pH = 2.5）時(shí)樣品含量及峰對(duì)稱度均為最佳[12-16]。

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