徐若烊,王大慧,許宏慶,衛(wèi)功元

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇蘇州 215123)

S-腺苷蛋氨酸(SAM)和谷胱甘肽(GSH)均為廣泛存在于生物體內(nèi)的含硫小分子活性化合物。SAM由底物L(fēng)-蛋氨酸和ATP經(jīng)S-腺苷蛋氨酸合成酶催化合成,參與生物體內(nèi)40多種生化反應(yīng),具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫和轉(zhuǎn)氨丙基等作用[1-2]。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸反應(yīng)生成的活性三肽物質(zhì),在維持生物體內(nèi)適宜的氧化還原環(huán)境、保護(hù)蛋白質(zhì)的巰基免受氧化、清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基等方面具有重要作用[3-4]。基于SAM和GSH在細(xì)胞內(nèi)的重要生理功能,這兩種含硫化合物在臨床醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)保健、食品加工和化妝品等諸多領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前,SAM和GSH的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶促轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法,其中酵母發(fā)酵法是最具有潛力的方法[5-6]。在酵母細(xì)胞中,作為L(zhǎng)-蛋氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)物質(zhì),SAM和GSH可以通過(guò)聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵的方法進(jìn)行生產(chǎn)[7-9]。SAM和GSH的生物合成均需要ATP的參與,胞內(nèi)能量物質(zhì)的水平是決定SAM和GSH能否聯(lián)合高產(chǎn)的關(guān)鍵因素[10]。前人研究發(fā)現(xiàn),外源ATP的添加可以有效促進(jìn)SAM和GSH的高產(chǎn)[11-12],但該方法并不經(jīng)濟(jì)。如果能設(shè)法提高酵母細(xì)胞內(nèi)源性ATP的含量,則有可能提高SAM和GSH的聯(lián)產(chǎn)水平。

針對(duì)胞內(nèi)ATP水平的調(diào)控,常用的方法為優(yōu)化分批發(fā)酵的供氧水平或添加外源的輔助性能源物質(zhì)[13]。為了實(shí)現(xiàn)SAM和GSH聯(lián)合高產(chǎn),前期研究采用了兩階段溶氧控制策略,SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)量比恒定轉(zhuǎn)速條件下提高6.5%[14]。此外,在分批發(fā)酵的6 h向發(fā)酵液中添加10 g/L檸檬酸鈉,SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)量比未添加的對(duì)照組提高了13%[15]。然而,這些發(fā)酵優(yōu)化策略促進(jìn)SAM和GSH聯(lián)合高產(chǎn)的生理學(xué)機(jī)制仍有待明確。

丙酮酸鈉是一種化學(xué)工業(yè)中常用的廉價(jià)化合物,在好氧發(fā)酵過(guò)程中可以作為替代碳源或能量輔助物質(zhì),進(jìn)而提高目標(biāo)產(chǎn)物的高產(chǎn)[16]。為此,本文擬研究丙酮酸鈉對(duì)SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵的影響,從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、關(guān)鍵酶活性和胞內(nèi)能量物質(zhì)水平及比率等角度對(duì)丙酮酸鈉促進(jìn)SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵的生理機(jī)制進(jìn)行解析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)朊假絲酵母(CandidautilisSZU 07-01) 為蘇州大學(xué)微生物生理與代謝調(diào)控研究室保藏;SAM、GSH、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)、谷胱甘肽還原酶、丙酮酸鈉、L-蛋氨酸、蛋白胨和酵母膏等 生工生物工程(上海)股份有限公司;硫酸鎂、硫酸銨、磷酸二氫鉀和氯化鈣 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、己糖激酶檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所;異檸檬酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司;種子培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母粉10 g/L,pH6.0;發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖35 g/L,硫酸銨10 g/L,磷酸二氫鉀12.3 g/L,蛋氨酸4.6 g/L,硫酸鎂0.05 g/L,氯化鈣0.05 g/L,pH5.0。

5 L Minifors攪拌式發(fā)酵罐 瑞士Infors公司;Waters 1525高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司;LD5-2A離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HZ-2010K搖床 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司;SW-CJ-2A超凈工作臺(tái) 吳江市龍宏凈化設(shè)備有限公司;LDZX-50KB滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 取-70 ℃冷藏種子活化后接入種子培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)20 h,溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。

1.2.2 搖床發(fā)酵培養(yǎng) 按10%(v/v)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)30 h,溫度30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。

1.2.3 丙酮酸鈉添加對(duì)SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵的影響 在搖床培養(yǎng)條件下,以不添加丙酮酸鈉作為對(duì)照,分別在0 h、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期(6 h)和葡萄糖消耗結(jié)束時(shí)(12 h)添加1、2、3和4 g/L的丙酮酸鈉,培養(yǎng)至30 h,取樣測(cè)定生物量、SAM和GSH濃度,比較酵母細(xì)胞生長(zhǎng)、SAM和GSH合成情況,總結(jié)丙酮酸鈉對(duì)SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵的影響規(guī)律。

1.2.4 分批發(fā)酵培養(yǎng) 按10%(v/v)的接種量將種子接種至裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,在30 ℃、350 r/min和1 vvm條件下通氣培養(yǎng)30 h。pH采用梅特勒電極在位監(jiān)測(cè),通過(guò)自動(dòng)流加3 mol/L H2SO4或3 mol/L NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié),以維持pH變化在5.0±0.02范圍內(nèi)。在分批培養(yǎng)的不同時(shí)間定時(shí)取樣,樣品經(jīng)處理后檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)、SAM和GSH合成情況。

1.2.5 丙酮酸鈉促進(jìn)SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵生理機(jī)制解析 在產(chǎn)朊假絲酵母分批培養(yǎng)條件下,以不添加丙酮酸鈉作為對(duì)照組,以在搖瓶中優(yōu)化后的方法進(jìn)行丙酮酸鈉添加作為丙酮酸鈉組,定時(shí)取樣,檢測(cè)胞內(nèi)能量物質(zhì)NADH、NAD+、ATP和ADP含量,測(cè)定胞內(nèi)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、S-腺苷蛋氨酸合成酶、己糖激酶和異檸檬酸脫氫酶活性,通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組胞內(nèi)能量物質(zhì)水平和比率以及關(guān)鍵酶活性大小,解析丙酮酸鈉促進(jìn)產(chǎn)朊假絲酵母聯(lián)產(chǎn)SAM和GSH的生理機(jī)制。

1.2.6 酵母生物量和葡萄糖濃度的測(cè)定 以細(xì)胞干重(DCW)表示酵母生物量。取10 mL發(fā)酵液于3500 r/min下離心10 min,蒸餾水洗滌3次,相同轉(zhuǎn)速下離心10 min,收集菌體,70 ℃烘干至恒重;葡萄糖濃度的測(cè)定采用3,5二硝基水楊酸法[17]。

1.2.7 胞內(nèi)SAM、GSH的提取 分別采用0.35 mmol/L硫酸和40%(v/v)乙醇對(duì)胞內(nèi)SAM和GSH進(jìn)行提取[18]。

1.2.8 代謝物質(zhì)濃度測(cè)定 胞內(nèi)能量物質(zhì)如NADH、NAD+、ATP和ADP的定量測(cè)定方法,SAM和GSH的定量測(cè)定方法,以及胞內(nèi)SAM含量(ISC)和GSH含量(IGC)的定義及計(jì)算方法,參見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。

1.2.9 酶活測(cè)定γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、己糖激酶(HK)和異檸檬酸脫氫酶(IDH)采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定,操作方法和步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;S-腺苷蛋氨酸合成酶(MAT)通過(guò)測(cè)定酶促反應(yīng)液中的SAM含量來(lái)進(jìn)行檢測(cè)[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有搖瓶實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)樣品的平均值,所有分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為兩次檢測(cè)結(jié)果的平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件(IBM公司)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)的可信度采用t-檢驗(yàn)進(jìn)行分析,當(dāng)p<0.05時(shí)認(rèn)為有顯著影響。

表1 丙酮酸鈉添加對(duì)SAM和GSH生物合成的影響Table 1 Effect of sodium pyruvate addition on the biosynthesis of SAM and GSH

注:同列中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05),字母相同代表差異不顯著(p>0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 丙酮酸鈉對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母生物合成SAM和GSH的影響

搖瓶培養(yǎng)條件下,考察丙酮酸鈉在C.utilisSZU 07-01生物合成SAM和GSH中的作用,結(jié)果如表1所示?？梢钥闯?與不添加丙酮酸鈉的空白對(duì)照相比,丙酮酸鈉添加沒(méi)有促進(jìn)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng),細(xì)胞干重變化不大。然而,在酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的前期(如0 h)添加丙酮酸鈉有利于SAM和GSH的生物合成,SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)量均有所提高。在0 h添加2 g/L丙酮酸鈉時(shí),SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)量達(dá)到433.4 mg/L,是對(duì)照實(shí)驗(yàn)條件下的1.29倍。由此,以下選用0 h添加2 g/L丙酮酸鈉作為分批發(fā)酵培養(yǎng)條件,深入研究丙酮酸鈉對(duì)SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵的影響及其生理機(jī)制。

2.2 丙酮酸鈉在SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵中的作用

在5 L發(fā)酵罐中對(duì)C.utilisSZU 07-01進(jìn)行分批培養(yǎng),根據(jù)表1中較優(yōu)的方法添加丙酮酸鈉(即在0 h添加2 g/L丙酮酸鈉),考察細(xì)胞生長(zhǎng)以及SAM和GSH合成情況,結(jié)果如圖1所示。SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程參數(shù)比較總結(jié)于表2。與搖瓶培養(yǎng)所呈現(xiàn)的結(jié)果不同,添加丙酮酸鈉在溶解氧充足的情況下,促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng),至18 h時(shí),細(xì)胞干重達(dá)到最大值,比對(duì)照提高了20.5%。在好氧發(fā)酵中,酵母細(xì)胞代謝丙酮酸鈉產(chǎn)生了大量的能量物質(zhì),這將大大節(jié)約用于能量合成的葡萄糖的消耗,最終有更多的葡萄糖參與細(xì)胞生長(zhǎng),進(jìn)而提高了細(xì)胞干重的水平。

表2 SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程參數(shù)比較Table 2 Comparison of kinetic parameters involved in batch co-production of SAM and GSH

注:同行中不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(p<0.05),字母相同代表差異不顯著(p>0.05)。

與此同時(shí),丙酮酸鈉的添加也提高了SAM和GSH的合成速率,SAM和GSH的產(chǎn)量一直高于對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1B、圖1C)。至27 h時(shí),GSH產(chǎn)量達(dá)到最大值222.2 mg/L,比對(duì)照組提高了18.1%;至30 h時(shí),SAM產(chǎn)量達(dá)到最大值191.2 mg/L,比對(duì)照組高出53.2%。最終,SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)量在27 h達(dá)到最大值402.3 mg/L,比對(duì)照提高35.1%(表2)。

進(jìn)而對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間下的酵母胞內(nèi)SAM和GSH含量進(jìn)行比較,結(jié)果如圖2所示?？梢园l(fā)現(xiàn),丙酮酸鈉的添加有利于產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)GSH的過(guò)量合成和積累,胞內(nèi)GSH含量一直高于對(duì)照;對(duì)于SAM合成,丙酮酸鈉添加的影響主要體現(xiàn)在細(xì)胞生長(zhǎng)的穩(wěn)定期(12 h之后),胞內(nèi)SAM含量與對(duì)照相比有較大幅度的提高。酵母胞內(nèi)SAM和GSH含量的高低體現(xiàn)了細(xì)胞合成SAM和GSH能力的大小,丙酮酸鈉的添加提高了SAM和GSH的聯(lián)產(chǎn)量,不僅僅是因?yàn)榇龠M(jìn)了C.utilisSZU 07-01細(xì)胞的生長(zhǎng),還因?yàn)槠涮嵘私湍讣?xì)胞合成SAM和GSH的能力。以下將分別從酵母胞內(nèi)SAM和GSH合成的關(guān)鍵酶活性、與能量代謝相關(guān)酶活性和物質(zhì)水平的變化規(guī)律等角度對(duì)丙酮酸鈉促進(jìn)SAM和GSH合成的生理機(jī)制進(jìn)行探討。

圖2 產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)SAM和GSH含量變化Fig.2 Time-course of intracellular contents of SAM and GSH in C. utilis

2.3 丙酮酸鈉促進(jìn)SAM和GSH聯(lián)合高產(chǎn)的生理機(jī)制

2.3.1 S-腺苷蛋氨酸合成酶和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性 S-腺苷蛋氨酸合成酶(MAT)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)分別為酵母細(xì)胞內(nèi)SAM和GSH生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶,MAT和γ-GCS的活性與SAM和GSH的合成速率密切相關(guān)[5-6]。為此,分別測(cè)定了SAM和GSH快速合成期時(shí)的MAT酶活(15 h和21 h)和γ-GCS酶活(9 h和15 h),結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?丙酮酸鈉的添加有利于MAT和γ-GCS活性的提高。與對(duì)照相比,MAT酶活在15 h和21 h分別提高了8.1%和9.4%,γ-GCS酶活在9 h和15 h分別提高了9.7%和15.0%,這表明C.utilisSZU 07-01在丙酮酸鈉存在的情況下具有更高的合成SAM和GSH的內(nèi)在動(dòng)力,能實(shí)現(xiàn)SAM和GSH的過(guò)量合成,并最終進(jìn)一步提高了SAM和GSH的聯(lián)產(chǎn)量。

圖3 添加丙酮酸鈉對(duì)MAT和γ-GCS活性的影響Fig.3 Effect of sodium pyruvate addition on the activities of MAT and γ-GCS注：不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(p<0.05),圖4、圖5同。

2.3.2 己糖激酶和異檸檬酸脫氫酶活性 己糖激酶(HK)是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶之一,其活性的高低與葡萄糖的消耗速率有著緊密的關(guān)系;異檸檬酸脫氫酶(IDH)是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶之一,其活性的提高有助于細(xì)胞在有氧環(huán)境中產(chǎn)生大量的NADH,進(jìn)而為細(xì)胞代謝提供足夠的能量[20-21]。為此,分別測(cè)定了分批培養(yǎng)9 h和15 h時(shí)的HK和IDH活性,結(jié)果如圖4所示。可以看出,在細(xì)胞的快速生長(zhǎng)期(9 h),丙酮酸鈉的添加對(duì)HK活性幾乎沒(méi)有影響,但在15 h時(shí)HK活性比對(duì)照提高了近30%,表明丙酮酸鈉可以在發(fā)酵中后期(15 h)提高酵母細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用能力。對(duì)于IDH來(lái)說(shuō),丙酮酸鈉添加后,其活性在9 h和15 h時(shí)均高于對(duì)照,分別提高了13.2%和43.9%。IDH活性的提高將有利于線(xiàn)粒體內(nèi)NADH水平的增加,為能量物質(zhì)ATP的合成提供更多的底物來(lái)源。

圖5 添加丙酮酸鈉對(duì)胞內(nèi)NADH和ATP含量及NADH/NAD+和ATP/ADP比率的影響Fig.5 Effect of sodium pyruvate addition on intracellular levels of NADH and ATP and ratios of NADH/NAD+ and ATP/ADP

圖4 添加丙酮酸鈉對(duì)產(chǎn)朊假絲 酵母胞內(nèi)HK和IDH活性的影響Fig.4 Effect of sodium pyruvate addition on the activities of HK and IDH in Candida utilis

2.3.3 胞內(nèi)能量物質(zhì)水平及其比率 ATP是生物體內(nèi)重要的能量物質(zhì)和輔因子,參與多種生化反應(yīng)過(guò)程[22]。在酵母細(xì)胞中,ATP除了為細(xì)胞代謝提供能量之外,還是SAM和GSH生物合成的前體物質(zhì),因此胞內(nèi)ATP含量及再生能力對(duì)于SAM和GSH聯(lián)合高產(chǎn)具有決定性的作用[10]。在好氧發(fā)酵過(guò)程中,ATP是由NADH經(jīng)電子傳遞鏈氧化而形成的,故胞內(nèi)NADH含量的高低可以作為ATP能否高效合成的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖1可以看出,在9 h之后SAM和GSH進(jìn)入快速合成期。為此,分別測(cè)定了分批培養(yǎng)9 h和15 h時(shí)的胞內(nèi)能量代謝物質(zhì)(ATP、ADP、NADH和NAD+),計(jì)算出胞內(nèi)NADH含量(NADH/DCW)和ATP含量(ATP/DCW)以及NADH/NAD+和ATP/ADP比率,結(jié)果如圖5所示。

可以發(fā)現(xiàn),丙酮酸鈉的添加提高了發(fā)酵前期(9 h)的胞內(nèi)NADH和ATP含量,其水平分別是對(duì)照的2.57倍和3.36倍。由于此時(shí)NADH/NAD+和ATP/ADP比率也明顯高于對(duì)照,說(shuō)明丙酮酸鈉的存在可以顯著增加胞內(nèi)ATP的供給。至15 h時(shí),雖然丙酮酸鈉的存在能繼續(xù)將胞內(nèi)NADH維持在更高的水平,但是胞內(nèi)ATP含量和ATP/ADP比率明顯低于對(duì)照,說(shuō)明有更多的ATP被用于細(xì)胞代謝以及SAM和GSH的生物合成中。酵母胞內(nèi)較高的NADH和ATP含量為SAM和GSH的過(guò)量合成提供了更加充足的底物保障,并最終實(shí)現(xiàn)SAM和GSH的聯(lián)合高產(chǎn)。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間添加不同濃度丙酮酸鈉的SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在0 h添加2 g/L丙酮酸鈉可以有效地提高產(chǎn)朊假絲酵母生物合成SAM和GSH,分批培養(yǎng)條件下SAM和GSH的聯(lián)產(chǎn)量比對(duì)照提高了35.1%。對(duì)分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)丙酮酸鈉的添加提升了酵母細(xì)胞合成SAM和GSH的能力。酵母胞內(nèi)SAM和GSH合成的關(guān)鍵酶活性、與能量代謝相關(guān)酶活性和物質(zhì)水平的變化規(guī)律表明,丙酮酸鈉提高了SAM和GSH合成期的HK和IDH酶活性、MAT和γ-GCS酶活性,以及胞內(nèi)能量代謝物質(zhì)的水平和比率,最終實(shí)現(xiàn)了SAM和GSH的聯(lián)合高產(chǎn)。該研究結(jié)果為類(lèi)似耗能合成化合物的高效生產(chǎn)提供了一種可行的思路。

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