郭熾鵬，陸春，朱國興

中山大學附屬第三醫(yī)院皮膚性病科，廣州 510630

解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum，U.urealyticum)感染可引起泌尿生殖系統(tǒng)疾病，也可導致腦、肺等其他器官損傷。目前，用于治療解脲脲原體感染的抗菌藥物主要有喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類，有關解脲脲原體對上述藥物的耐藥性研究已有報道。解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物耐藥性增加的原因主要為gyrA、gyrB、parC和parE等基因的突變；對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性增加的原因主要為23S rRNA亞基或核糖體蛋白L4或L22基因的突變；對四環(huán)素類藥物耐藥性增加的原因主要為tet(M)的存在[1-11]。不同研究表明，以上這些耐藥突變位點的分布存在差異，生物膜的產(chǎn)生可能加重耐藥現(xiàn)象[12-13]。目前，關于解脲脲原體對喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類藥物耐藥性的研究主要集中在檢測上述突變位點。研究過程主要包括以下幾個步驟：①利用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增目的基因；②對PCR產(chǎn)物進行測序；③與相應ATCC株進行序列比對并找出突變位點等[6,11,14]。本文通過PubMed檢索近幾年有關解脲脲原體耐藥性的相關研究，對已發(fā)現(xiàn)的耐藥位點分布和生物膜形成前后藥敏變化進行歸納整理，以期加深對其耐藥機制的了解并指導耐藥菌快速檢測，從而加強抗菌藥物管理并減少耐藥性產(chǎn)生。

1 喹諾酮類藥物的耐藥突變

對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制研究主要集中在對gyrA、gyrB、parC和parE等基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining region，QRDR)相關突變位點的檢測。許多研究表明，發(fā)生于parC基因的典型突變S83L是導致解脲脲原體對喹諾酮類藥物耐藥性增加的常見原因[15-16]，Kawai等[14]研究表明，該突變可能導致喹諾酮類藥物對解脲脲原體的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)增加32倍。然而，并非所有研究均在耐藥菌株中檢測到上述4個基因突變[15,17]。在部分關于左氧氟沙星耐藥分離株的研究中，未能在gyrA、gyrB或parE等基因中檢出突變位點存在。

Piccinelli等[18]對篩選出的85株對環(huán)丙沙星和(或)氧氟沙星耐藥的支原體進行分析，證實了一些已報道的突變位點，如parC中出現(xiàn)的S83L、E87Q和E87K，ParE中的R448K等。該研究結果顯示，對于從gyrA擴增出的基因片段，最常見的突變是L176F，其他突變位點包括存在于微小脲原體(Ureaplasmaparvum，U.parvum)中的F67I、K78I、G179D、S174R，以及解脲脲原體(T960)中的D77V。在parC中檢出4個突變：微小脲原體中的V141I(該突變導致對氧氟沙星產(chǎn)生中等程度耐藥)，以及解脲脲原體(T960)中的I52N、L49F和E153D。通過對gyrB基因序列進行檢測，發(fā)現(xiàn)微小脲原體分離株中存在E502Q、R523等突變，并在1株解脲脲原體(T960)分離株中發(fā)現(xiàn)三重突變。在5株微小脲原體菌株中檢測到parE基因中的6個點突變：Q412K、Q412P、S413N、H491Q、E466K和M404L。上述突變導致相應表達蛋白發(fā)生7個氨基酸替換。

不同突變可存在于同一基因中，如有研究發(fā)現(xiàn)耐喹諾酮類藥物的解脲脲原體血清型1中同時存在F67I和K78I兩個點突變[18]。同一菌株中也可能存在兩個基因的雙重突變。對于微小脲原體不同血清型和解脲脲原體兩種生物群混雜感染的分離株，Piccinelli等在其中3株分離株中發(fā)現(xiàn)了如下突變：gyrA中的L176F、雙重突變(gyrA基因中的L176F和parE基因中的Q412T)。Kawai等[14]在一份DNA樣品中同時檢出存在于gyrB基因和parC基因中的點突變(分別為P462S和S83L)。

并非所有基因突變均能導致耐藥性產(chǎn)生。例如，在一些多重突變菌株中檢測到S83L，因此除S83L外可能存在中性突變。Valentine-King等[17]在對喹諾酮類藥物敏感的解脲脲原體分離株中發(fā)現(xiàn)了存在于parE基因QRDR內(nèi)的兩個突變位點，其中一個導致R437I非同義替換，另一個導致G480S非同義替換，該分離株對左氧氟沙星和環(huán)丙沙星均較敏感(MIC分別為1 μg/mL和2 μg/mL)，與其他受試菌株的敏感性一致。因此，這種突變雖然位于parE的QRDR，但似乎不會降低喹諾酮類藥物的有效性。

在對耐藥位點的檢測中還發(fā)現(xiàn)了一些尚未證明是否介導耐藥的突變位點，如發(fā)生于gyrA基因的L176F，gyrB基因的E502Q，以及parE基因的Q412K、Q412P、Q412T等[18]。

為評價parC基因S83L和S83W突變對表達產(chǎn)物結構變化的影響，Kawai等[14]通過同源建模等技術對各肽的結構模型進行預測分析，發(fā)現(xiàn)喹諾酮C-3羧酸、C-4羰基和Mg2+對其與DNA拓撲異構酶的相互作用有重要影響，而S83L和S83W可通過位阻作用干擾菌株與喹諾酮類藥物的適當結合。

2 四環(huán)素類藥物的耐藥突變

對四環(huán)素類藥物的耐藥機制研究主要集中在tet(M)檢測。Valentine-King等[17]對四環(huán)素類耐藥解脲脲原體分離株和4株敏感分離株中的tet(M)片段進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)檢測，獲得約400 bp的條帶，相當于解脲脲原體ATCC 33175中的tet(M)位置，而敏感分離株中未檢測到該基因。

然而，并非檢測出tet(M)決定簇的菌株均對四環(huán)素類產(chǎn)生耐藥。Fernández等[15]在250株分離株中篩選與四環(huán)素類耐藥相關的tet(M)決定簇，發(fā)現(xiàn)10株(4.9%)微小脲原體分離株呈陽性(其中僅1株對四環(huán)素耐藥，另外9株的四環(huán)素和多西環(huán)素MIC均較低)，而在解脲脲原體(T960)中未分離出該基因。Kotrotsiou等[19]利用A7瓊脂平板，從100例成人泌尿生殖系統(tǒng)中分離出解脲脲原體，其中87份標本分離出微小脲原體，12份標本分離出解脲脲原體(T960)，兩生物群均從單一樣品中分離出來，且所有分離株均對四環(huán)素表型敏感。檢測上述樣本，發(fā)現(xiàn)35株攜帶tet(M)，其中29株(82.9%)為微小脲原體、5株(14.3%)為解脲脲原體(T960)、1株(2.9%)為微小脲原體/解脲脲原體(T960)混合株，3組間無統(tǒng)計學差異。10例有癥狀男性患者中有4例(40%)tet(M)攜帶者，34例有癥狀女性患者有11例(32.4%)tet(M)攜帶者，而56例無癥狀婦女中亦有20例(35.7%)tet(M)攜帶者，3組間無統(tǒng)計學差異。

生殖器支原體對四環(huán)素類產(chǎn)生耐藥性主要是由于獲得了tet(M)決定簇，該過程通常與Tn916/Tn1545家族的接合轉座子元件相關。Mardassi等[20]對取自突尼斯境內(nèi)部分不育癥患者的20株微小脲原體和2株解脲脲原體(T960)分離株進行四環(huán)素耐藥性評估，并通過PCR檢測tet(M)和int-Tn(int-Tn基因編碼Tn916/Tn1545樣轉座子的整合酶)。微小脲原體對四環(huán)素的耐藥率為 22.72%，且所有耐藥菌株均含tet(M)和int-Tn序列。對tet(M)擴增子的核苷酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)微小脲原體和解脲脲原體(T960)中所有耐四環(huán)素分離株均具有一種獨特的序列。分子分型研究表明，單個tet(M)基因序列最有可能通過Tn916/Tn1545樣轉座子來傳遞，從而導致微小脲原體和人型支原體(Mycoplasmhominis)分離株中出現(xiàn)大部分四環(huán)素耐藥突變株。tet(M)基因序列存在于不同支原體屬中，且廣泛存在于系統(tǒng)發(fā)育狀態(tài)不同的菌株中。一個合理的解釋是，它可能受益于有效的水平轉移環(huán)境，從而具有高度的傳播能力。

3 大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥突變

對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥機制研究主要集中在對23S rRNA亞基或核糖體蛋白L4或L22基因的檢測。Govender等[11]在對紅霉素(2株)和紅霉素+阿奇霉素(1株)產(chǎn)生耐藥性的3株微小脲原體中觀察到L22核糖體蛋白突變，其中菌株Up-8顯示6個氨基酸改變，Up-38顯示3個氨基酸改變，Up-71顯示6個氨基酸改變。而在另一株紅霉素+阿奇霉素抗性菌株中未檢測到L22蛋白變化。4株菌株未發(fā)現(xiàn)以下序列突變：兩個23S rRNA操縱子；大環(huán)內(nèi)酯修飾基因erm(A)、erm(B)、erm(C)和erm(E)；外排泵基因msr(A)、msr(B)、msr(C)和msr(D)。

Dando等[21]通過實驗研究，對12只懷孕母羊于妊娠55 d時進行羊膜內(nèi)接種，接種物為含多種微小脲原體亞型的臨床株。隨后于妊娠100 d時用紅霉素治療(肌內(nèi)注射，每日30 mg/kg，n=6)或注射生理鹽水(肌內(nèi)注射，n=6)，并于妊娠125 d后經(jīng)外科手術取出胎羊。盡管所有母羊注射了相同接種物，但慢性羊膜內(nèi)感染后，在羊水和絨毛膜羊膜內(nèi)檢測到的脲原體存在顯著差異。從絨毛膜羊膜(而不是羊水)中分離出的脲原體23S rRNA基因的結構域Ⅴ中觀察到許多多態(tài)性，導致鑲嵌樣序列形成。絨毛膜羊膜分離株還含有大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因erm(B)和msr(D)，且與羅紅霉素MIC有關。值得注意的是，這種變化與脲原體是否接觸紅霉素無關，表明低劑量紅霉素不會誘導子宮內(nèi)脲原體對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥。

4 生物膜形成與耐藥性

解脲脲原體具有形成生物膜的能力，有研究提示其生物膜形成后藥物敏感性下降。García-Castillo等[12]對9株具有生物膜形成能力的解脲脲原體進行研究，發(fā)現(xiàn)生物膜形成前后菌株的耐藥性發(fā)生如下變化：紅霉素0%對44%(P=0.02)，泰利霉素22%對77%(P=0.02)，環(huán)丙沙星66%對100%，左氧氟沙星0%對33%，四環(huán)素0%對33%；所有菌株在生物膜形成前后均對克拉霉素敏感。Feng等[13]對69株解脲脲原體進行研究，發(fā)現(xiàn)42株為耐藥株(同時耐環(huán)丙沙星和氧氟沙星)，27株為敏感株(對環(huán)丙沙星和氧氟沙星均敏感)，且耐藥菌比敏感菌產(chǎn)生更多生物膜(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，生物膜形成后MIC增加，代謝相關基因ureC表達增加(P<0.05)，但喹諾酮類耐藥相關基因gyrA的表達在生物膜形成前后無統(tǒng)計學差異。

也有研究顯示，生物膜形成前后解脲脲原體的藥物敏感性無統(tǒng)計學差異。Pandelidis等[22]檢測來自早產(chǎn)新生兒的43株臨床分離株和5株ATCC菌株在生物膜形成前后的藥物敏感性，發(fā)現(xiàn)生物膜形成前后阿奇霉素和紅霉素的藥物敏感性無統(tǒng)計學差異。阿奇霉素對解脲脲原體(T960)臨床分離株的MIC50和50%最小生物膜形成抑制濃度(50% minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC50)高于微小脲原體，但支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)嬰兒與非BPD嬰兒的MIC或MBIC無差異。

5 藥物敏感性與多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)

上述研究主要集中于對已知突變位點的檢測，而MLST為研究解脲脲原體耐藥株的分布提供了新的思路。為更好地了解解脲脲原體的分子流行病學和群體結構，Zhang等[23]開發(fā)了基于解脲脲原體4個管家基因(ftsH、rpL22、valS、thrS)的MLST方案，應用于藥物敏感性菌株研究，并檢測超流行譜系和致病株。Fernández等[15]使用針對4個管家基因的引物，對46株分離株[30 株微小脲原體和16株解脲脲原體(T960)]進行MLST分析，包括左氧氟沙星耐藥分離株、所有攜帶tet(M)分離株，以及代表不同研究時期和樣品來源的一組敏感分離株，利用eBURST軟件建立克隆性并確定分離物之間的潛在關系。MLST結果顯示，30株微小脲原體存在14個克隆群，屬于同一克隆復合體(clonal complex，CC)且具有3個共有基因座的ST1和ST56是最常見的克隆群，分別有6株和5株。16株解脲脲原體(T960)中存在7個譜，其中ST47(5株)和ST9(3株)屬于同一CC，且最為常見。eBURST軟件分析提示，有3個主要簇(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和1個獨立的不可分組的克隆群(兩個分離物)存在。 Ⅰ類群包括整個微小脲原體分離株，而解脲脲原體(T960)分離株大部分分布在Ⅱ類和Ⅲ類群，但該研究未觀察到ST與微生物耐藥性之間的相關性。目前，解脲脲原體藥物敏感性與MLST相關研究仍較少，需更多研究來支持。

6 結語

解脲脲原體耐藥性研究對指導臨床用藥及減少耐藥性發(fā)生有重要意義，但目前研究方法和檢驗手段仍較為傳統(tǒng)、局限，研究方案也僅停留在對前人實驗的重復。在完善耐藥機制研究的基礎上，如何實現(xiàn)對耐藥株的快速鑒定，從而指導抗菌藥物的合理選擇等仍需進一步研究。