張曉曉，陳雙雙，鄭 婷，酈 楓，劉 鵬

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/浙江省野生動(dòng)物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江金華 321004)

鋁是土壤中最主要的金屬元素，通常以難溶性鋁硅酸鹽或氧化鋁等穩(wěn)定的絡(luò)合物形式存在，對(duì)植物無(wú)毒害作用，但當(dāng)土壤pH值<5時(shí)，難溶性鋁會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄凿X離子，并隨著環(huán)境污染的加劇呈指數(shù)型增長(zhǎng)。近幾年南方紅壤區(qū)土壤酸化面積加大，酸化程度日趨嚴(yán)重，造成鋁毒害現(xiàn)象加重，導(dǎo)致該區(qū)耕地的生產(chǎn)力和質(zhì)量都逐步下降[1]。有研究表明，當(dāng)土壤交換性鋁含量過(guò)多時(shí)，植物會(huì)表現(xiàn)出明顯的鋁毒害癥狀，主要為根尖結(jié)構(gòu)被破壞以及根系的伸長(zhǎng)和吸收功能被抑制，從而影響作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。

虎舌紅(ArdisiamamillataHance)屬紫金?？?Myrsinaceae)常綠小灌木，具有匍匐的木質(zhì)根狀莖，葉片紅潤(rùn)橢圓形，其紅紫色茸毛可折射出七彩佛光，故又稱佛光紅[2]；株形優(yōu)美，葉果皆可以觀賞，果實(shí)成熟期較長(zhǎng)，周年不落，老果新果同掛一株，色澤紅而發(fā)亮，甚為美觀。適應(yīng)性強(qiáng)的虎舌紅既可在各地居室中盆栽，也可在園林中作耐陰地被植物，且易栽培管理。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)虎舌紅的研究主要針對(duì)化學(xué)成分的種類[3]、功效[4-5]及繁殖技術(shù)[6]等方面，而對(duì)虎舌紅逆境脅迫下的探究較少，僅少數(shù)學(xué)者探索紫金?？谱辖鹋Ardisiajaponica(Thunb) Blume][7]和堇葉紫金牛(Ardisiaviolacea)[8]對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)，而對(duì)價(jià)值高的虎舌紅在紅壤環(huán)境下的抗鋁性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。有研究顯示，一定濃度A13+處理可抑制大豆 [Glycinemax(Linn.) Merr.][9-10]根系的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其脂質(zhì)過(guò)氧化[11]等；此外，較高濃度的鋁脅迫也可導(dǎo)致水稻(OryzasativaL.)出現(xiàn)枯萎黃化等明顯受傷癥狀[12]。因此，筆者以虎舌紅為試驗(yàn)材料，通過(guò)溶液培養(yǎng)法研究鋁脅迫下其葉片活性氧的代謝情況和光合光響應(yīng)特性，探討其對(duì)鋁毒害響應(yīng)的生理機(jī)制，揭示其在鋁脅迫下的抗逆性大小，為紫金牛科植物虎舌紅的抗鋁性和緩解土壤鋁毒害的研究提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)材料為生長(zhǎng)一致的盆栽虎舌紅(二年生扦插苗)，野生扦插苗采于江西省大余縣吉村鎮(zhèn)山區(qū)。盆栽用塑料花盆上、下口的平均直徑分別為28、15 cm，高度為20 cm，每盆定植苗木1株。1盆土壤質(zhì)量約3 kg，盆底放置2層塑料紙。在光照培養(yǎng)室內(nèi)土培適應(yīng)1個(gè)月后，先將其轉(zhuǎn)入Hoagland’s半完全營(yíng)養(yǎng)液中適應(yīng)15 d，然后于完全營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培育和脅迫處理。試驗(yàn)設(shè)計(jì)5個(gè)鋁離子(Al3+)濃度處理，分別為 0 μmol/L(CK)、200 μmol/L(T1)、500 μmol/L(T2)、1 000 μmol/L(T3)和2 000 μmol/L(T4)，各處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。處理期間，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，在脅迫處理7、14、21 d 08：00—12：00 取頂端的第3～4張成熟葉片，測(cè)定其相關(guān)生理指標(biāo)。

1.2 測(cè)定方法

采用愈創(chuàng)木酚法[13]測(cè)定葉片過(guò)氧化物酶(POD)活性，氮藍(lán)四唑(NBT)法[12]測(cè)定葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性，紫外吸收法[13]測(cè)定葉片過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，硫代巴比妥酸法[13]測(cè)定丙二醛(MDA)含量，PAM-210葉綠素測(cè)定儀測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)[13]，丙酮研磨法[13]測(cè)定葉綠素a、b含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，以單因素方差分析法和Duncan’s法進(jìn)行顯著性差異分析，用Excel 2013、Origin 9.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片SOD、POD、CAT活性的影響

2.1.1 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片SOD的影響 超氧化物歧化酶(SOD)廣泛存在于生物體內(nèi)，專一性地清除生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有毒害作用的超氧陰離子自由基。從圖1可以看出，Al3+脅迫期間，隨脅迫濃度的增大，虎舌紅葉片的SOD活性先升高后降低，其中T2處理時(shí)達(dá)到最大值。低濃度T2處理組SOD活性與CK差異顯著，且脅迫14、21 d時(shí)任一處理組SOD活性均高于CK，說(shuō)明在Al3+處理下虎舌紅葉片通過(guò)迅速增加SOD活性來(lái)保護(hù)細(xì)胞，在防止脅迫條件下活性氧含量增加導(dǎo)致的損害中起著重要作用。同時(shí)，Al3+處理7、14、21 d時(shí)，低濃度T1下SOD活性增幅分別為7.34%、17.16%、32.59%，高濃度T4下增幅分別為3.14%、9.78%、9.43%，可見(jiàn)低濃度對(duì)SOD活性的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于高濃度。

在脅迫7、14、21 d時(shí)，處理組虎舌紅葉片SOD活性相比CK的最大增幅依次為37.07%、57.11%、74.43%，表明在脅迫初期，虎舌紅葉片的SOD活性被小幅度誘導(dǎo)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)其被誘導(dǎo)的幅度逐漸增加，說(shuō)明脅迫后期虎舌紅表現(xiàn)出了對(duì)Al3+脅迫的適應(yīng)性。

2.1.2 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片POD的影響 過(guò)氧化物酶(POD)是一類性質(zhì)比較穩(wěn)定的氧化還原酶類，可催化由過(guò)氧化氫(H2O2)參與的各種還原劑的氧化反應(yīng)，在植物對(duì)環(huán)境的應(yīng)答方面起著重要的調(diào)節(jié)和保護(hù)作用。由圖1可知，除T4處理外，虎舌紅葉片的POD活性與脅迫濃度呈正相關(guān)關(guān)系，在低濃度T1處理下，POD活性保持在低水平狀態(tài)，最大增幅為54.83%；而在中濃度T3與高濃度T4處理下，處理組的POD活性與CK存在顯著差異，最小增幅為100.85%，表明較高的Al3+濃度更能激發(fā)虎舌紅葉片POD活性的上升以維持虎舌紅葉片活性氧代謝的平衡。

鋁脅迫7、14、21 d時(shí)，虎舌紅葉片的POD活性分別比對(duì)照上升了27.37%～218.71%、21.81%～239.87%、54.83%～420.48%，說(shuō)明虎舌紅葉片的POD活性與脅迫時(shí)間整體上呈正相關(guān)關(guān)系，與脅迫濃度的影響情況基本一致。

2.1.3 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片CAT的影響 植物代謝產(chǎn)物H2O2對(duì)植物細(xì)胞具有損傷作用，而過(guò)氧化氫酶(CAT)是清除H2O2的主要酶類，可保護(hù)植物細(xì)胞。目前研究已證實(shí)增強(qiáng)植物抗逆性的途徑之一是提高植物體內(nèi)抗氧化酶類活性及增強(qiáng)抗氧化代謝的水平。圖1表明，在鋁脅迫條件下，處理組虎舌紅葉片CAT活性在3個(gè)處理期(7、14、21 d)均低于CK，分別為CK的33.88%～95.14%、49.91%～79.78%、59.27%～73.64%，且同一時(shí)期內(nèi)隨脅迫濃度的增大其活性總體呈降低的趨勢(shì)。同時(shí)還可以看出，T1、T2、T3處理下虎舌紅葉片CAT活性的最低值均出現(xiàn)在脅迫21 d，而T4組CAT活性最低值在脅迫7 d，表明中低濃度(T1、T2、T3)處理與高濃度(T4)處理下的虎舌紅對(duì)脅迫時(shí)間的反應(yīng)存在一定差異。

SOD把超氧化物歧化為H2O2后，在一定強(qiáng)度的環(huán)境脅迫下CAT和POD有互補(bǔ)的作用，脅迫期間POD活性變化趨勢(shì)與CAT相反，因此本試驗(yàn)中虎舌紅葉片CAT活性的降低可能有利于POD活性的增加與其功能的發(fā)揮。

2.2 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片丙二醛含量的影響

植物器官在逆境條件下，通常會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化，而MDA可反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度以及植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱。由圖2可知，鋁脅迫條件下，虎舌紅葉片內(nèi)的MDA含量增加，且具有濃度效應(yīng)，即隨脅迫濃度的增加，虎舌紅葉片內(nèi)的MDA含量增加得越明顯，3個(gè)處理期的平均脅迫濃度從T1增加到T4時(shí)，MDA含量從對(duì)照的112.10%上升為對(duì)照的216.86%；且當(dāng)濃度為T(mén)2時(shí)MDA含量開(kāi)始與對(duì)照組產(chǎn)生明顯差異，不同時(shí)期(處理14、21 d)T2組的MDA含量分別為對(duì)照的143.44%、153.44%，反映出脅迫濃度越大，虎舌紅葉片的膜脂過(guò)氧化越嚴(yán)重。當(dāng)處理時(shí)間由7 d延長(zhǎng)到21 d時(shí)，MDA含量最大增幅由132.08%降到了95.70%，表明脅迫時(shí)間對(duì)葉片MDA含量的影響與濃度不一致。

2.3 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片葉綠素?zé)晒獾挠绊?/h3>

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)是快速檢測(cè)植物光合機(jī)構(gòu)損傷程度的靈敏探針，可反映植物光合生理特性與逆境脅迫的關(guān)系。由表1可知，脅迫7、14 d時(shí)，F(xiàn)o均在T2處理時(shí)達(dá)到最大值，較對(duì)照分別增加54.83%、57.00%，而當(dāng)脅迫21 d時(shí)，T3濃度時(shí)Fo被顯著抑制27.61%，這說(shuō)明虎舌紅葉片在較高鋁濃度處理下光合效率會(huì)受到輕微損害。T2、T3、T4處理組的Fm在脅迫7 d時(shí)有顯著變化，而當(dāng)處理14、21 d時(shí)，低鋁處理下Fm明顯增加，高鋁濃度下表現(xiàn)出被抑制。ETR為電子傳遞速率，處理7、14 d時(shí)，ETR均在T2被顯著抑制，最高被抑制了43.95%，而至脅迫21 d時(shí)各濃度處理下變化較小。 高濃度下Yield在前2個(gè)處理時(shí)間均無(wú)顯著變化，低鋁濃度對(duì)其有微小促進(jìn)作用。光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)反映光抑制(Photosystem II)天線色數(shù)吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)的份額。脅迫7 d時(shí)，在T1處理下增大14.84%，而在T2處理下減小，脅迫21 d時(shí)，高濃度有顯著變化。qN為非光化學(xué)猝滅系數(shù)，在脅迫第1周期內(nèi)整體上隨鋁濃度的增加呈先增大后減小再增大的趨勢(shì)，表明低鋁濃度下虎舌紅葉片可通過(guò)增加qN來(lái)緩解逆境脅迫帶來(lái)的傷害。

表1 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

注：Fo表示最小熒光；Fm表示最大熒光產(chǎn)量；ETR表示表觀電子傳遞速率；Yield表示熒光量子效率；qP表示光化學(xué)淬滅系數(shù)；qN表示非光化學(xué)淬滅參數(shù)；同欄同列數(shù)據(jù)后的不同小寫(xiě)寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 鋁脅迫對(duì)虎舌紅葉片葉綠素a、b含量的影響

葉綠素廣泛存在于綠色植物體內(nèi)，具有著色和營(yíng)養(yǎng)雙重功效，是植物光合色素中最重要的一類色素，而其中以葉綠素a、葉綠素b尤為重要。在鋁脅迫下，虎舌紅葉片葉綠素含量不僅直接關(guān)系著虎舌紅光合同化過(guò)程，而且是衡量其抗逆性的重要指標(biāo)之一。從圖3可以看出，Al3+處理下虎舌紅葉片的葉綠素a含量、葉綠素b含量以及葉綠素a+b含量隨脅迫濃度的增加均呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，在T2處理下達(dá)到最大值。同時(shí)，在T2處理下葉綠素a的含量在脅迫7、14、21 d 后的增幅分別為120.03%、48.81%、54.32%，葉綠素b含量的增幅分別為95.90%、50.91%、49.65%，葉綠素a+b含量的增幅分別為114.58%、49.41%、52.87%，表明低濃度且短時(shí)間的鋁脅迫有利于虎舌紅葉片葉綠素的積累。

虎舌紅葉片葉綠素b含量整體上隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，而葉綠素a與葉綠素a+b含量整體上隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，說(shuō)明輕度脅迫能誘導(dǎo)虎舌紅葉片葉綠素含量的上升，且最適誘導(dǎo)濃度為500 μmol/L，而重度脅迫則對(duì)葉綠素含量產(chǎn)生抑制作用，可反映出重度脅迫下虎舌紅葉片活性氧代謝減慢。

3 討論與結(jié)論

鋁是地殼中最豐富的金屬元素，當(dāng)其表現(xiàn)為細(xì)胞毒性形式時(shí)，可通過(guò)作用在根尖區(qū)而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)抑制。鋁的毒性作用機(jī)制可能是因?yàn)榧?xì)胞骨架失真、胼胝質(zhì)堆積對(duì)質(zhì)膜表面電荷的干擾，從而引起膜的脂質(zhì)過(guò)氧化[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在鋁脅迫下虎舌紅會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激、膜脂過(guò)氧化以及光合速率下降等現(xiàn)象，但抗鋁響應(yīng)程度存在一定的差異。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與CK相比，中度鋁脅迫能誘導(dǎo)虎舌紅SOD、POD活性上升，但高濃度鋁脅迫下僅CAT活性被抑制，這可能是由于鋁脅迫濃度超過(guò)其耐受度[15]所致。Chen等指出，金屬離子通過(guò)損害SOD等酶引起氧化脅迫[16]，符合高鋁脅迫下抗氧化酶活性被顯著抑制的現(xiàn)象；Brej報(bào)道顯示，冰草[Agropyroncristatum(L.) Gaertn.(Gramineae.)]葉片中的CAT活性在重金屬脅迫下顯著上升[17]，而本試驗(yàn)說(shuō)明虎舌紅CAT活性在不同脅迫濃度下均被抑制，這表明CAT可能不是其抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵酶。逆境下植物體內(nèi)MDA含量會(huì)增加，含量越高表示受傷害的程度越大。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度的鋁使虎舌紅葉片MDA含量升高，說(shuō)明鋁脅迫作用可導(dǎo)致虎舌紅葉片中活性氧等的大量產(chǎn)生，引發(fā)膜質(zhì)過(guò)氧化，這與Ylmaz等金屬脅迫下的研究結(jié)果[18-21]一致。

光合作用是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過(guò)程，在特定條件下所測(cè)得的光合能力可作為評(píng)估植物自身狀態(tài)的重要生理指標(biāo)，而葉片的光合速率與植物的自身因素(葉綠素含量、葉片厚度等)密切相關(guān)，同時(shí)又受到光照強(qiáng)度、氣溫、空氣相對(duì)濕度等外界因素的限制，因此逆境鋁脅迫對(duì)光合作用的影響過(guò)程是極其復(fù)雜的。本試驗(yàn)對(duì)虎舌紅葉片的葉綠素含量以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測(cè)定，從結(jié)果來(lái)看，一方面可知高鋁濃度會(huì)抑制虎舌紅的光合作用，但隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)效果減弱；而另一方面說(shuō)明，前2個(gè)周期低鋁濃度(T2、T3)下虎舌紅可通過(guò)部分熒光參數(shù)Fo、Yield、qN以及葉綠素含量的增加緩解鋁毒作用，這與馬新明等輕度干旱脅迫下葉片光系統(tǒng)Ⅱ活性和光化學(xué)最大效率的增加結(jié)果[21]相一致。光合色素中的葉綠素在光合作用過(guò)程中起著接收和轉(zhuǎn)換能量的作用，能將光能轉(zhuǎn)換成化學(xué)能，其中葉綠素a分子執(zhí)行能量轉(zhuǎn)化，葉綠素b是光色素蛋白復(fù)合體的重要組成部分，其作用主要在于捕獲和傳遞光能，因此推測(cè)鋁脅迫可能通過(guò)抑制或減弱葉綠素對(duì)光能的吸收和轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)毒害作用，而植物可通過(guò)增加葉綠素含量來(lái)抵消低鋁脅迫對(duì)自身造成的損害，卻無(wú)法抵抗高鋁脅迫帶來(lái)的傷害。

綜上所述，鋁脅迫引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)活性氧等的過(guò)度積累及其所導(dǎo)致的膜脂過(guò)氧化對(duì)葉綠素a、葉綠素b合成的影響可能是脅迫傷害虎舌紅幼苗的主要原因，雖然較高濃度的Al3+對(duì)虎舌紅造成某種程度的損害，但低濃度的Al3+對(duì)虎舌紅的生長(zhǎng)沒(méi)有損傷，相反有適當(dāng)?shù)拇龠M(jìn)作用，因此虎舌紅具有較強(qiáng)的抗鋁性，并且可通過(guò)SOD活性、POD活性、葉綠素含量以及Fo、Yield、qN的增加來(lái)抵御鋁毒害，從而使自身得以生存和生長(zhǎng)，但虎舌紅只能在一定濃度范圍內(nèi)抵御鋁脅迫，因此對(duì)高濃度鋁脅迫要提前做好預(yù)防措施。

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