周艷芬, 王芳煥, 王澤嵐, 詹海鵑, 劉萬毅, 孟 哲*

(1. 寧夏大學化學化工學院, 省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室, 寧夏 銀川 750021; 2. 寧夏出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心, 寧夏 銀川 750001)

二甲雙胍作為II型糖尿病臨床使用最為普遍的口服降血糖藥之一,對于改善糖代謝和胰島素抵抗等起著重要作用[1,2],是目前用于單純飲食控制和保護心血管的首選降糖藥物[3,4]。此外,長期的臨床治療發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能提高腫瘤患者的生存期,因而受到廣泛關注[5,6]。為確保鹽酸二甲雙胍藥品的安全性和有效性,《中華人民共和國藥典》2015版二部[7]規(guī)定,鹽酸二甲雙胍制劑中有關物質雙氰胺的含量不得超過鹽酸二甲雙胍標示量的0.02%,其他雜質含量低于0.1%,而對三聚氰胺的限量未作明確規(guī)定。在鹽酸二甲雙胍的合成工藝中,不可避免地會引入雜質三聚氰胺及前驅體雙氰胺,二者毒性較大,必須嚴格控制藥品中的殘留量,以確?；颊哂盟幍陌踩院退幤返挠行?。因此,快速、準確地鑒別及測定鹽酸二甲雙胍制劑中殘留的三聚氰胺和雙氰胺,一直是相關制藥企業(yè)關心的問題,也是確保藥品質量安全的關鍵。

三聚氰胺的檢測方法包括衍生化-氣相色譜-質譜法[8]、高效液相色譜法[9]、薄層色譜法[10]、毛細管電泳法[11]、高效液相色譜-質譜法[12]和表面增強拉曼散射光譜法[13]等,其檢測基質多為乳制品。而針對乳制品中三聚氰胺和雙氰胺殘留同時檢測的研究報道則較少[14-16],其中凈化處理是三聚氰胺和雙氰胺同時測定的難點。Meng等[16]采用混合型陽離子交換Cleanert PCX固相萃取小柱富集復雜樣品中微量的三聚氰胺和雙氰胺,三聚氰胺的回收率大于90%,而雙氰胺的回收率不到20%。

隨著治療觀念的轉變,創(chuàng)新藥物制劑愈發(fā)成為醫(yī)藥界研究的熱點[17]。市售二甲雙胍制劑包括片劑、緩釋片、膠囊和腸溶片等,制劑基質的復雜性對微量的雙氰胺和三聚氰胺雜質的同時提取帶來了困難。同時測定鹽酸二甲雙胍制劑中鹽酸二甲雙胍及殘留物雙氰胺和三聚氰胺的研究還未見報道。而串聯(lián)混合模式的固相萃取方法已被證明能夠較好地消除基質干擾,最大限度地增加目標分析物的回收率[18,19]。

本文采用超聲輔助溶出結合串聯(lián)雙柱固相萃取的前處理技術,建立了高效液相色譜-電噴霧多級質譜(HPLC-ESI/MSn)測定鹽酸二甲雙胍制劑中鹽酸二甲雙胍及殘留物雙氰胺和三聚氰胺的分析方法。ESI/MSn質譜信息對HPLC可能產生的假陽性誤判提供進一步確證[20]。該方法中二甲雙胍、三聚氰胺和雙氰胺的檢出限均低于文獻報道[14,15],因此該方法既能滿足鹽酸二甲雙胍含量的測定要求,又能滿足二甲雙胍制劑中相關物質三聚氰胺和雙氰胺殘留的測定要求,為評價分析鹽酸二甲雙胍制劑的質量安全提供科學的實驗數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Dionex Ultimate 3000 UHPLC超高效液相色譜儀,配有LTQ-XL增強型線性離子阱質譜儀(ESI源)(美國Thermo Fisher Scientific公司); Kromasil-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm, 3.5 μm,瑞典AkzoNobel公司); TGL-16M高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司); QL-866旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器有限公司); HGC-12A氮吹儀(金屬浴)(河北潤創(chuàng)科技開發(fā)有限公司); Cleanert PCX、Cleanert PEP和C18 SPE小柱(規(guī)格均為60 mg/3 mL,天津博納艾杰爾公司); 0.22 μm尼龍濾膜(美國Waters公司)。

甲醇和乙腈(色譜純,美國Thermo Fisher Scientific公司);甲酸、乙酸(色譜純,美國Sigma-Aldrich公司)。鹽酸二甲雙胍、三聚氰胺和雙氰胺標準品(日本東京化成工業(yè)株式會社),純度均大于98%,其結構式見圖1。其他試劑均為分析純,實驗用水均為去離子水。

圖 1 二甲雙胍、三聚氰胺和雙氰胺的結構式Fig. 1 Structures of metformin, melamine and dicyandiamide

供試樣品為鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司,批準文號:國藥準字H20023370;深圳市中聯(lián)制藥有限公司,批準文號:國藥準字H44024853;上海上藥信誼藥廠有限公司,批準文號:國藥準字H31022081;北京中惠藥業(yè)有限公司,批準文號:國藥準字H19983069);鹽酸二甲雙胍緩釋片(南昌市飛弘藥業(yè)有限公司,批準文號:國藥準字H20051662;北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責任公司,批準文號:國藥準字H20041985);鹽酸二甲雙胍腸溶片(貴州天安藥業(yè)股份有限公司,批準文號:國藥準字H52020960;河北天成藥業(yè)股份有限公司,批準文號:國藥準字H20031134);鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊(北京圣永制藥有限公司,批準文號:國藥準字H10980064;深圳市中聯(lián)制藥有限公司,批準文號:國藥準字H20094132)。以上供試品均購自當?shù)蒯t(yī)藥公司。

1.2 標準溶液的配制

標準溶液的配制:分別稱取鹽酸二甲雙胍、三聚氰胺和雙氰胺標準品各250 mg(精確至0.1 mg),以甲醇為溶劑分別配制成1 000 mg/L的標準儲備液,于4 ℃冰箱保存。準確移取一定體積的各目標物標準儲備液,以流動相為溶劑配制成10 mg/L的混合標準溶液。

基質匹配標準溶液的配制:取200 mg空白樣品(輔料)溶于含0.1%(v/v)乙酸的無水乙醇溶液中,超聲30 min,以13 000 r/min離心20 min,移取上層清液作為溶劑，配制10 mg/L的混合基質匹配標準溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

對實際制劑樣品進行研磨(膠囊去包衣),過60目篩(0.25 mm),裝袋、密封于干燥器中,4 ℃保存。

稱取0.05 g(精確至0.1 mg)研磨過篩后的樣品粉末,置于10 mL具塞塑料管中,加入5 mL含0.1%(v/v)乙酸的無水乙醇溶液溶解,于室溫下超聲提取30 min后,以13 000 r/min離心10 min,移取上層清液,置于100 mL容量瓶中,用純凈水定容,待凈化。

1.3.2 凈化

將Cleanert PCX SPE小柱用串接頭串聯(lián)在Cleanert C18 SPE小柱上方,用3 mL甲醇和3 mL去離子水活化Cleanert PCX-C18串聯(lián)固相萃取雙柱,準確移取20 μL 1.3.1節(jié)的待凈化液,用純凈水稀釋至1 mL后上樣。先以3 mL純凈水洗滌小柱,再用3 mL 5%(v/v)氨水甲醇溶液進行洗脫,重復2次,用20 mL氮吹管收集洗脫液,于45 ℃金屬浴中氮氣吹干,用1 mL的流動相溶解,旋渦1 min,過0.22 μm微孔濾膜,轉移至自動進樣瓶,待HPLC-ESI-MSn分析。

1.4 色譜條件

Kromasil-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm, 3.5 μm);柱溫:35 ℃;流動相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和甲醇(B);流速:0.30 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 98%A～95%A; 2.0～7.0 min, 95%A～90%A; 7.0～8.0 min, 90%A～20%A; 8.0～8.5 min, 20%A～98%A; 8.5～10.0 min, 98%A。進樣量:10 μL。

1.5 質譜條件

離子源:ESI源,正離子模式;毛細管溫度:320 ℃;毛細管電壓:4 kV;鞘氣流速:25 arb;輔助氣流速:10 arb;吹掃氣流速:30 arb;多級掃描碰撞氣:99.999 9%高純氦氣;全掃描模式的掃描范圍:m/z60～300;多級串聯(lián)掃描模式的掃描范圍:m/z40～200。在ESI+模式下,二甲雙胍、三聚氰胺及雙氰胺的保留時間、一級母離子和二級碎片離子見表1。

表 1 3種目標分析物的保留時間、一級母離子和二級碎片離子Table 1 Retention times, MS1 parent ions and MS2 fragment ions of the three target analytes

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

國家標準方法[21]采用選擇性色譜柱(強陽離子交換與反相C18混合填料)(150 mm×4.6 mm, 5 μm)檢測原料乳與乳制品中的三聚氰胺,其方法的定量限為2 mg/kg。《中華人民共和國藥典》2015版規(guī)定采用C18色譜柱配合離子對試劑檢測雙氰胺[7]。其他研究報道[14,15]多采用選擇性氨基色譜柱同時檢測食品中的三聚氰胺和雙氰胺,氨基色譜柱有利于三聚氰胺和雙氰胺的保留,三聚氰胺和雙氰胺的定量限分別為0.17 mg/kg和0.15 mg/kg[14]。合格藥品制劑中三聚氰胺和雙氰胺的殘留量很低,而且制劑基質成分復雜,因此不適合選用以上選擇性色譜柱同時分離二甲雙胍、三聚氰胺及雙氰胺3種目標物。本實驗采用Syncronis-C18超高效液相色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國Thermo Fisher Scientific公司)和Kromasil-C18高效液相色譜柱(100 mm×4.6 mm, 3.5 μm,瑞典Akzo-Nobel公司)對0.1 mg/L的混合標準溶液進行分離。結果表明，Kromasil-C18柱對三聚氰胺、二甲雙胍和雙氰胺的保留(保留時間分別為3.46、3.56和4.01 min)優(yōu)于Syncronis-C18色譜柱(保留時間分別為0.98、1.20和1.31 min); Kromasil-C18色譜柱對三聚氰胺、二甲雙胍和雙氰胺的分離效果優(yōu)于Syncronis-C18色譜柱。因此選擇Kromasil-C18色譜柱用于分析。

在選擇Kromasil-C18色譜柱的條件下,首先考察了甲醇-水、乙腈-水作為流動相對3種目標化合物的色譜行為和離子化程度的影響。結果表明,當流動相為甲醇-水時,儀器響應值高于乙腈-水為流動相時的響應值,且目標化合物在甲醇-水流動相中的色譜分離效果優(yōu)于乙腈-水。此外,還考察了在甲醇-水流動相體系的水相中分別加入0.1%(v/v)甲酸、0.1%(v/v)乙酸、5 mmol/L乙酸銨等揮發(fā)性添加劑的影響。結果表明,以甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液為流動相時,混合標準溶液(0.1 mg/L)中3種目標化合物獲得了最優(yōu)的色譜分離效果和相對豐度最強的質譜信號響應(提取離子流色譜圖見圖2)。這是由于目標物二甲雙胍、三聚氰胺和雙氰胺具有弱堿性,當流動相中加入一定量的酸性物質(如甲酸)時,會促進目標物的電離,并為陽離子的形成提供必需的質子來源,從而提高其離子化效率。

通過對比3種目標分析物(0.1 mg/L)在混合標準溶液和基質加標溶液中的提取離子流色譜圖,可以看出基質效應不影響目標物的保留時間(ΔtR<0.1 min),但對3種目標物離子化信號強度存在一定程度的抑制,尤其對雙氰胺影響較大,所以定量分析應采用基質加標工作曲線。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

為獲得目標化合物的最佳質譜參數(shù),實驗采用針泵直接進樣,分別測定了每一種化合物在ESI+和ESI-模式下的質譜信號強度。在ESI+電離模式下,二甲雙胍、三聚氰胺和雙氰胺均易得到響應強度較高的[M+H]+準分子離子峰,m/z分別為130.01、127.07和85.07。多級串聯(lián)掃描模式測定可以同時獲得化合物的多個特征碎片離子信息,使化合物的確認更加準確。通過對目標化合物母離子碰撞能的優(yōu)化,裂解電壓在30 V時得到3種分析物的二級碎片離子及裂解規(guī)律(見圖3)。根據(jù)多級串聯(lián)質譜掃描結果,在全掃描模式下選擇離子豐度高、干擾小的母離子與特征碎片離子及對應的保留時間用于目標物的定性分析;選擇靈敏度較高的選擇離子掃描模式(SIM)用于目標分析物的定量分析。

圖 3 3種目標化合物在ESI+模式下的二級質譜圖Fig. 3 MS2 spectra of the three target compounds in ESI+mode

2.3 提取液的選擇

市售二甲雙胍制劑包括片劑、緩釋片、膠囊和腸溶片等,制劑基質的復雜性取決于藥品生產和調配處方時所用的賦形劑和附加劑[17]。我國常用藥品輔料包括防腐劑、抗氧化劑、矯味劑和表面活性劑等。由于藥用輔料的品種較多,成分復雜,造成了藥品制劑中微量雜質檢測的困難。二甲雙胍片劑和膠囊制劑易溶于水,而緩釋片和腸溶片制劑遇水膨脹呈膠狀而不溶。在超聲輔助下,分別比較了0.1%(v/v)乙酸水溶液、甲醇-水(1∶1, v/v)溶液、50%(v/v)甲醇水溶液(含0.1%(v/v)乙酸)、乙醇-水(1∶1, v/v)溶液和含0.1%(v/v)乙酸的無水乙醇溶液溶解二甲雙胍制劑的效果。研究過程發(fā)現(xiàn),含0.1%乙酸(v/v)的無水乙醇溶液能夠快速地溶解二甲雙胍片劑、膠囊、緩釋制劑和腸溶制劑,而其他溶劑不能有效地溶解所有劑型，因此選為實驗所用。

在HPLC-ESI-MSn分析中,基質效應更多是伴隨被分析物共流出噴霧針的內源性物質產生的，其干擾被分析物的霧化、揮發(fā)、裂解及帶電荷過程，導致最終進入質譜的離子減少(離子抑制)或增強(離子增強),從而影響定量結果的可靠性和準確性[22,23]?？紤]到制劑輔料的基質效應,本研究在超聲輔助、含0.1%(v/v)乙酸的無水乙醇溶液溶解制劑樣品后加標,采用串聯(lián)Cleanert PCX-C18固相萃取雙柱濃縮和凈化目標物,利用HPLC-ESI-MSn分析檢測,基質匹配標準曲線計算,分別考察了不同鹽酸二甲雙胍制劑(片劑、膠囊、緩釋制劑及腸溶制劑)樣品加標后輔料基質對目標化合物(0.1 mg/L)保留時間和離子化信號的影響(見圖4)。結果顯示,目標化合物二甲雙胍、三聚氰胺和雙氰胺在不同制劑樣品中的平均加標回收率為86.8%、101.1%和70.4%。實驗結果表明,超聲輔助和采用含0.1%(v/v)乙酸的無水乙醇溶液作為溶劑對制劑樣品中的分析物具有很好的溶出能力。采用基質匹配標準曲線計算可有效地補償不同制劑輔料存在的基質效應；采用串聯(lián)雙柱富集凈化目標物提高了雙氰胺的回收率。

圖 4 3種目標化合物(0.1 mg/L)在不同鹽酸二甲雙胍制劑中的加標回收率(n=3)Fig. 4 Spiked recoveries of the three target compounds (0.1 mg/L) in different metformin hydrochloride preparations (n=3)

CompoundRegressionequationr2Linearrange/(μg/L)LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)Metforminy=2.27×105+1.13×103x0.999210-100002.628.65Melaminey=1.86×105+1.29×103x0.999410-100001.485.96Dicyandiamidey=1.80×104+2.83×102x0.999950-1000013.6145.67

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.4 固相萃取柱和洗脫劑的優(yōu)化

圖 5 不同固相萃取柱和洗脫劑對目標化合物回收率的影響Fig. 5 Effect of different SPE cartridges and eluents on recoveries of the target compounds

鹽酸二甲雙胍、三聚氰胺和雙氰胺均呈現(xiàn)弱堿性,文獻報道[14,15]多采用Cleanert PCX小柱濃縮和凈化該類化合物。實驗分別采用Cleanert PCX、Cleanert PEP、C18和串聯(lián)Cleanert PCX-C18固相萃取雙柱濃縮和凈化加標樣品,同時考察了不同洗脫溶劑(含0.1%(v/v)乙酸的甲醇溶液、甲醇和5%(v/v)氨水甲醇溶液,堿性逐漸增加)對目標化合物回收率的影響(見圖5)。采用控制變量法和基質匹配標準曲線定量計算,對比3種目標化合物的回收率。實驗發(fā)現(xiàn),隨著洗脫劑堿性的增大,無論采用何種固相萃取柱凈化,二甲雙胍、三聚氰胺和雙氰胺3種目標物的回收率均有所提高。表明5%(v/v)氨水甲醇洗脫劑的洗脫能力較強,其原因是洗脫劑中的銨根離子與柱上吸附的目標化合物發(fā)生離子交換。對比采用5%(v/v)氨水甲醇作為洗脫劑時3種目標物的回收率,發(fā)現(xiàn)二甲雙胍、三聚氰胺和雙氰胺經串聯(lián)的Cleanert PCX-C18雙柱凈化后的回收率均高于采用其他固相萃取小柱。綜合上述結果,本實驗采用串聯(lián)Cleanert PCX-C18雙柱,以5%(v/v)氨水甲醇為洗脫劑,不僅實現(xiàn)了快速除去制劑藥液中各種藥物輔料的目標,獲得較高回收率和靈敏度,還有利于保護色譜柱和電離源。

2.5 標準曲線、線性范圍和檢出限

在上述1.3節(jié)和1.4節(jié)的條件下,采用基質匹配混合標準工作溶液(0.01～20 mg/L)，以目標化合物的質量濃度為橫坐標(x, μg/L)、對應的峰面積為縱坐標(y)繪制基質匹配標準曲線。結果表明,3種目標化合物在一定范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系,相關系數(shù)(r2)≥0.999 2(見表2)。以S/N=3和S/N=10時的質量濃度為檢出限(LOD)和定量限(LOQ),由表2可知,二甲雙胍、三聚氰胺和雙氰胺的LOD值分別為2.62、1.48和13.61 μg/kg, LOQ值分別為8.65、5.96和45.67 μg/kg,均優(yōu)于文獻方法[14,15]。

2.6 回收率和精密度

在1.3節(jié)和1.4節(jié)條件下,向二甲雙胍片劑樣品中添加50、100和500 μg/L的混合標準溶液,采用基質匹配標準曲線進行回收率測定,每個加標水平下分別測定5份平行樣品。結果顯示,二甲雙胍、三聚氰胺和雙氰胺在3個加標水平下的平均回收率均不小于80.45%、90.30%和65.02%,其相對標準偏差均不大于10.65%、8.34%和13.41%(見表3)。

表3 鹽酸二甲雙胍片劑樣品中3種目標物的平均加標回收率和相對標準偏差(n=5)Table3 AveragespikedrecoveriesandRSDsofthethreetargetcompoundsinmetforminhydrochloridetabletsamples(n=5) Compound50μg/LRecovery/%RSD/%100μg/LRecovery/%RSD/%500μg/LRecovery/%RSD/%Metformin80.4510.6590.056.9095.406.10Melamine90.308.34102.235.56118.334.22Dicyandiamide65.0213.4170.528.0178.027.73

對每個加標樣品進行精密度試驗，日內連續(xù)測定5次,連續(xù)測量5天,日內和日間回收率的RSD小于15%,重復性良好，滿足藥品制劑中殘留雜質的檢測要求。

2.7 實際樣品檢測

將本方法用于4種鹽酸二甲雙胍制劑(10個樣品)中二甲雙胍及殘留物三聚氰胺和雙氰胺的確證及測定。依據(jù)化合物的保留時間和質譜信息中離子相對豐度比來確認樣品中的目標物,根據(jù)基質匹配標準曲線測定樣品中相應的目標物含量(見表4)。由表4可知,所有二甲雙胍制劑樣品中均發(fā)現(xiàn)雙氰胺和三聚氰胺殘留。依據(jù)《中華人民共和國藥典》2015版二部的規(guī)定,雙氰胺的限量低于鹽酸二甲雙胍標示量的0.02%,通過計算實際樣品中殘留雙氰胺與二甲雙胍的比值,各種制劑中雙氰胺的殘留量均有超過限量0.02%的情況,所以嚴格監(jiān)管二甲雙胍制劑中雙氰胺的殘留量非常必要。在所有制劑中,三聚氰胺的檢出率均為100%,但其殘留量均低于方法的定量限,無法準確定量。

表 4 不同鹽酸二甲雙胍制劑樣品中3種目標物的含量(n=5)Table 4 Contents of the three target compounds in different metformin hydrochloride preparation samples (n=5)

3 結論

本文以含0.1%(v/v)乙酸的無水乙醇溶液作為提取劑,超聲輔助提取鹽酸二甲雙胍制劑中的主要成分鹽酸二甲雙胍及殘留物三聚氰胺和雙氰胺,采用串聯(lián)Cleanert PCX-C18固相萃取雙柱濃縮、凈化,建立了HPLC-ESI-MSn法測定鹽酸二甲雙胍制劑中二甲雙胍及制劑殘留雜質三聚氰胺和雙氰胺。該方法完全能夠滿足國內外對二甲雙胍不同制劑(片劑、膠囊、緩釋片和腸溶片)中主要成分鹽酸二甲雙胍和殘留物三聚氰胺和雙氰胺的測定。

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