葉文雨 謝序澤 楊林青 邱學(xué)鴻牛曉慶 胡紅莉 余文英 魯國東

摘要 菌草（JUNCAO）是可作為栽培食用菌、藥用菌的草本植物。內(nèi)生固氮菌具有生物固氮的功能，可以促進植物生長，提高植物對病原菌的拮抗作用。采用無氮培養(yǎng)基、乙炔還原法等方法從巨菌草根中分離純化到1株具有較強固氮酶活性的菌株，固氮酶活性值為270.20 nmolC₂H₄/（mL·h）。通過16S rDNA序列分析，進一步確定該菌株屬于變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）。內(nèi)生固氮菌株fjg102對稻瘟病菌Guy11和Ku70的抑菌率分別為40.25%和44.30%，具有一定的抑制病原菌的作用。菌株fjg102革蘭氏染色陽性，具有溶磷作用、觸酶反應(yīng)為陽性、明膠液化為陽性等生理生化特性。盆栽試驗結(jié)果表明，接種fjg102菌株后對大麥有明顯的促生作用。其中葉長增加37.26%，根長增長9.40%，根重增加66.16%，鮮重增加96.40%，干重增加80%?？梢?，該內(nèi)生固氮菌株具有生物固氮和促生的效果，可進一步研究開發(fā)成為微生物肥料生產(chǎn)菌種。

植物的生長需要各種營養(yǎng)元素，氮是生長發(fā)育必須的大量營養(yǎng)元素之一?？諝庵械牡仨毻ㄟ^固氮微生物的轉(zhuǎn)化植物才能利用[1-2]。植物內(nèi)生固氮菌（Endophytic diazotroph）是指那些定殖在健康植物體內(nèi)，與宿主植物進行聯(lián)合固氮的一類微生物[3-4]。發(fā)掘植物內(nèi)生固氮菌資源遺傳多樣性已成為非豆科作物高效利用生物固氮戰(zhàn)略的主攻方向之一。內(nèi)生固氮菌可以促進植物生長、抑制植物病害、提高植物產(chǎn)量、降低化肥使用量，減少水土污染、保持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、改善生態(tài)環(huán)境[15]。內(nèi)生固氮菌有利于營養(yǎng)供應(yīng)和微環(huán)境適宜的生態(tài)位，避免了化合態(tài)氮的抑制及土著微生物的競爭，進而促進作物的生長及產(chǎn)量的提高[6-7]。野生稻內(nèi)生菌根瘤菌（Rhizo-bium）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）等對水稻紋枯病有一定的抑制作用[8]，芽孢桿菌（Bacillus）對赤霉病等病害可產(chǎn)生良好的防治效果[9]。高玲玲等[10]研究發(fā)現(xiàn)，多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對水稻白葉枯病、條斑病、稻瘟病、紋枯病和惡苗病等5種主要病原菌都有抑制作用。

菌草（JUNCAO）是可作為栽培食用菌、藥用菌的草本植物。巨菌草屬于禾本科植物狼尾草屬，具有營養(yǎng)豐富、植株高大、單位面積產(chǎn)量高、適應(yīng)性強、資源豐富、易于人工栽培、資源可持續(xù)利用等生物學(xué)特性，有較高的研究、開發(fā)和利用價值[11]。目前為止，已從甘蔗、水稻、小麥、玉米、白菜、芹菜等植物中分離到內(nèi)生固氮菌[12]，但對巨菌草內(nèi)生固氮菌的研究較少。為了探明巨菌草體內(nèi)是否存在高效的固氮菌及其固氮機理，本研究通過純培養(yǎng)手段和分子生物學(xué)手段對福州巨菌草內(nèi)生固氮菌進行了分離及生物學(xué)特性研究，以期揭示內(nèi)生固氮菌的特征，為豐富固氮微生物菌種資源庫和開發(fā)利用巨菌草內(nèi)生固氮菌提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年3月，采于福建農(nóng)林大學(xué)后山貧瘠山坡荒地，采集生長良好的巨菌草植株，立即用白封袋密封，帶回實驗室放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基

Dobereiner改良無氮培養(yǎng)基（簡稱DN） [13]： Sucrose 10 g/L; Malicacid5g/L; K₂HPO₄·H₂O₂ 0.2g/L;NaCl 0.1g/L; KH₂PO₄·H₂O₂ 0.4 g/L; FeCl₃ 0.01g/L;Na₂MoO₄ 0.002 g/L; MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L（單獨滅菌）;CaCl₂·H₂O 0.02 g/L（單獨滅菌）;Agar 1.5%/L（固體）;Agar 0.2%/L（半固體）;pH調(diào)至7.0;NFb培養(yǎng)基[14];malic acid 5.0 g/L， K₂HPO₄ 0.5 g/L; MgSO₄·7H₂O0.2 g/L; NaCl 0.1 g/L; CaCl₂ 0.02 g/L; bromthymolblue 0.5% （in KOH 0.2 mol/L）2.0 mL/L;

vitaminsolution 1mL/L; micronutrient solution 2mL/L;1.64% Fe-EDTA solution 4mL/L; KOH4.5 g/L; pH調(diào)至6.8。其中vitamin solution. biotin 100 mg/L;pyridoxol-HCl：200 mg/L; micronutrient solution： CuSO₄ 0.4g/L; ZnSO₄·7H₂O 0.12 g/L; H₂BO₃1.4g/L; Na₂MoO₄·2H₂O 1.0g/L; MnSO₄ 1.5 g/L（固體培養(yǎng)基中加入Agar 15 g/L.半固體培養(yǎng)基中加入Agar 2-4 g/L）;加碘反應(yīng)和觸酶反應(yīng)用LB固體培養(yǎng)基（LB液體培養(yǎng)基加瓊脂15g/L）;內(nèi)生細菌的運動作用用LB半固體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，瓊脂5g/L）：無機磷溶解PKO培養(yǎng)基（FeSO₄0.003 g/L，葡萄糖10g/L， Ca₃（PO₄）₂ 5.0 g/L，

（NH₄）₂SO₄0.5 g/L， MnSO₄0. 03 g/L，0.03g MgSO₄·7H₂O/L， NaCl 0.2 g/L， KCl 0.2 g/L，酵母膏0.5 g/L，瓊脂20 g /L， pH值6.8-7.0。其中Ca₃（PO₄）₂。過篩并單獨滅菌后與培養(yǎng)基混合）;淀粉水解用培養(yǎng)基（可溶性淀粉2g/L，NaCl 5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，瓊脂15g/L，配好后調(diào)PH至7.0）;明膠液化培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基1000mL/L，明膠12g/L，在水浴鍋中熔化混勻，調(diào)PH至7.2～7.4，121℃高壓滅菌，30 min）：病原菌拮抗試驗用PDA固體培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂40.1 g/L）。

1.3 菌株的分離、純化

菌株的分離、純化[14];將采集的新巨菌草植物樣本先用自來水沖洗，然后用剪刀剪下根并分別置于已滅菌的2個培養(yǎng)皿中，接著用70%的乙醇（C₂H₂OH）處理5 min（除去根表面的腐爛物質(zhì)），無菌水洗滌多次，再用2%的次氯酸鈉（NaCIO）消毒2～3min，無菌水洗滌5～7次.每次5～10 min。最后將表面消毒完全的根用手術(shù)刀切碎，分別接種到3支裝有NFb半固體培養(yǎng)基的試管中，密封后，置于溫度為28℃，濕度為85%的人工培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。待24 h后，向管內(nèi)注入1%體積的乙炔氣體，在同樣條件的人工培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，測定其固氮酶活性。將具有固氮活性的混合菌株接至固體NFb培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。再挑取單菌落分別涂板直到得到純的菌株為止。

1.4 內(nèi)生茵形態(tài)、培養(yǎng)特征

取培養(yǎng)48 h的菌株進行革蘭氏染色，觀察內(nèi)生菌的形態(tài)特征。

1.5 氣相色譜法測定固氮酶活性

固氮酶活性測定采用乙炔還原法[15]。將已純化的菌株再次接入盛有NFb半固體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，密封后，置于溫度為28℃，濕度為85%的人工培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。待24h后，向10mL試管內(nèi)注入1%體積的乙炔氣體，在同樣條件的人工培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，用SP-2100氣相色譜儀（北京分析儀器廠）測定其固氮酶活性。用下列公式計算固氮酶活性大?。篘= （hx×C×V）/（hs×24.9×t），式中，hx為樣品峰值（峰面積）;hs為標準C₂H₄峰值（峰面積）;C為標準C₂H₄的濃度（nmol/mL）;V為培養(yǎng)容器體積（mL）;t為樣品的培養(yǎng)時間，即C₂H₄的反應(yīng)時間（h）;N為產(chǎn)生的C₂H₄濃度（nmol/mL·h）。挑取固氮酶活性較高的樣品，用20%甘油于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 16S rDNA基因擴增

試劑盒抽提法提取內(nèi)生菌DNA。16S rDNA基因序列PCR擴增引物為細菌通用引物，27F（5'AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rDNA擴增。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，Taq Mix DNA聚合酶12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA1μL，去離子水10.5μL。PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s，56℃退火90s，72℃延伸2min， 30個循環(huán);72℃延伸10min，4℃保存。反應(yīng)完成后用1%的瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物送華大基因生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank （http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進行BLAST，選取與目標菌株相似性較近的菌株序列，使用ClustalX軟件進行同源性比對;利用MEGA 5.2軟件采用鄰近法（neighbor-joiningmethod）聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)定Bootstrap為1000，初步確定菌株的分類地位。

1.7 生物學(xué)特性

運動性試驗、觸酶試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、溶磷能力等試驗參照《微生物學(xué)實驗》[16]進行。

1.8 促生實驗

將活化得到的單菌落采用LB液體培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)48h，培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液（OD₆₀₀=0.6）.大麥生長3～4 d后，每盆澆灌菌液15 mL，同時澆灌同樣祥體積的清水作為對照，15d后測量大麥的葉長、根長、鮮重、干重等，計算菌株對大麥的促生作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)、培養(yǎng)特征

在固體LB培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)24h后，菌株fjg102形成乳白色不透明菌落，菌落近似圓形，邊緣整齊，中間有小突起，不分泌色素（圖1-A）;fjg102菌體細胞為短桿狀，革蘭氏阻性（圖1-B）。

2.2 分離純化及固氮酶活性的測定

采用培養(yǎng)基培養(yǎng)法從巨菌草（圖1-C）根中分離純化得到一株內(nèi)生固氮菌菌株fjg102。對該菌株用乙炔還原法進行固氮酶活性測定，其固氮酶活性值為270.20 nmol/mL·h，表明該菌株具有較強的固氮酶活性。

2.3 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育

擴增菌株16S rDNA約1500 bp長度的擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物交華大基因有限公司進行測序。將獲得的序列輸入到Genbank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對。將相似性比較相近的模式菌株序列用MEGA5.2軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2-A）。結(jié)果表明，菌株fjg102與變棲克雷伯氏菌（Kleb-siella variicola）親緣關(guān)系較近.其序列相似性均為99%）。結(jié)合其形態(tài)及其生理生化特征將fjg102可歸為變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）。

2.4 菌株的生理生化特性

2.4.1 觸酶試驗

觸酶可以催化將過氧化氫分解成為水和氧的反應(yīng)，觸酶的功能是將代謝過程產(chǎn)生的、具有毒性的過氧化氫除去，以保護細菌不被傷害。菌株fjg102觸酶反應(yīng)均為陽性（圖4），說明它們具有排除代謝中產(chǎn)生的過氧化氫的能力。

2.4.2 溶磷圈的產(chǎn)生

采用溶磷圈法菌株的溶磷性，巨菌草內(nèi)生菌fjg112菌株的周圍有溶磷圈出現(xiàn)，溶磷能力檢測的結(jié)果表明，該菌株具有溶磷能力，溶磷能力D/d（透明圈得直徑與菌落的直徑的比值）為1.07，具有一定的溶磷能力（圖4）。

2.4.3 運動性試驗

采用半固體培養(yǎng)基穿刺接種法，培養(yǎng)后觀察接種線及其周圍的生長狀況，有動力的細菌可在接種線周圍生長，造成模糊。無動力的則接種線清晰可見，周圍無生長。巨菌草內(nèi)生菌fjg102菌株的運動性檢測的結(jié)果表明，該菌株接種線清晰可見，說明該菌株不具有運動性能（圖5-A）。

2.4.4 明膠液化試驗

某些細菌可產(chǎn)生一種胞外酶明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動的液體。試驗結(jié)果表明，菌株fjg102具有膠原酶，使明膠被分解，失去凝固能力，呈現(xiàn)液體狀態(tài)，具有明膠液化現(xiàn)象（圖5-B）。

2.4.5 拮抗真菌實驗

采用平板對峙法檢測菌株fjg102對病原真菌的抑制效果，結(jié)果表明fjg102菌株對稻瘟病菌Guy11和Ku70的抑菌率分別為40.25%和44. 30%，對病原真菌具有一定的拮抗作用。

2.4.6 內(nèi)生固氮菌對大麥的促生作用

將活化得到的單菌落采用LB液體培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)48h，培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液（OD₆₀₀=0.6）每盆澆灌15mL于生長一周左右的大麥根部。15d后與未接種的對照相比，對大麥有明顯的促生作用（圖6）。其中葉長增加37.26%，根長增長9.40%.根重增加66.16%，鮮重增加96.40%，干重增加80%（表1）。

2.4.7 菌株對大麥的致病性分析

將活化得到的單菌落采用LB液體培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)48h，培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液（OD₆₀₀=0.6），接培養(yǎng)菌液于生長一周左右的大麥的葉片進行離體接菌，每處理重復(fù)3次，5～7d后調(diào)查葉片發(fā)病情況并拍照。結(jié)果表明菌株fjg102對大麥葉片沒有致病性（圖7）。

3 結(jié)論與討論

內(nèi)生固氮菌定殖于植物內(nèi)部，在植物細胞內(nèi)、細胞間隙、木質(zhì)部導(dǎo)管等進行固氮及其它促生作用。內(nèi)生固氮菌不僅能為宿主植物提供氮營養(yǎng)元素，而且還能促進植物生長，增強植物的抗逆性，是一類具有巨大應(yīng)用潛力的微生物資源。自內(nèi)生菌研究以來，許多學(xué)者在不同的植物中分離到了不同種的內(nèi)生固氮菌。如胡文哲等[17]從廣西野生稻分離到了5個內(nèi)生固氮菌類群;劉天增等從狗牙根中分離到內(nèi)生固氮菌等。已有學(xué)者從水稻、甘蔗等植物中分離到了變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）。已有研究表明，固氮菌能在甘蔗根和地上部分組織內(nèi)生存和定殖，可以有效促進甘蔗植株生長和對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收[18-20]。劉璇等[21]分離的固氮菌具有解鉀能力。龔鳳娟等[22]分離的固氮菌具有較高的ACC脫氨酶活性。葛安輝發(fā)現(xiàn)與變棲克雷伯氏菌（Kleb-siella variicola）的相似性高達99%聯(lián)合固氮菌株，羧甲基纖維素和甘油的添加能顯著提高該菌株的固氮酶活性[23]。本研究以福建巨菌草的根為材料，采用不同的選擇性培養(yǎng)基進行分離和純化，分離得到一株內(nèi)生固氮菌，經(jīng)16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定為變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola），表明該內(nèi)生固氮菌具有較高的固氮酶活性。該菌株還具有溶磷性、觸酶反應(yīng)為陽性、明膠液化為阻性等生物學(xué)特性。因此，本研究分離得到的變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）菌株在菌肥方面具有非常好的應(yīng)用前景。

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