向勇平，崔輝，劉丹，于杰，周立冬，楊建明，劉愛兵*

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)武警總醫(yī)院研究培養(yǎng)基地，北京 100039； 2. 武警總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100039； 3. 災(zāi)害救援醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100039； 4. 天津市陽權(quán)醫(yī)療器械有限公司，天津 300350； 5. 天津市港口醫(yī)院，天津 300350)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

內(nèi)毒素血癥可分為內(nèi)源性和外源性，內(nèi)源性內(nèi)毒素主要來源于腸腔內(nèi)細(xì)菌和毒素移位[1],嚴(yán)重的創(chuàng)傷應(yīng)激等可導(dǎo)致內(nèi)毒素通過受損的腸屏障入侵到體循環(huán)[2]，引發(fā)內(nèi)源性內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而引起一系列臨床癥狀。目前，內(nèi)毒素血癥治療方法有抗生素、抗內(nèi)毒素抗體、中醫(yī)藥等[3]?？股貢斐删w死亡破裂后產(chǎn)生更多的內(nèi)毒素，而引起更嚴(yán)重的臨床癥狀[4]?？箖?nèi)毒素抗體由于生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高價(jià)格貴大面積推廣尚不現(xiàn)實(shí)[5]。中醫(yī)藥治療內(nèi)毒素血癥的研究方面近年取得了一些進(jìn)展[6]。但以上治療方法均無法有效快速的降低患者體內(nèi)的內(nèi)毒素含量。據(jù)研究早期迅速有效地清除患者體內(nèi)的內(nèi)毒素,及時(shí)阻斷疾病的發(fā)生、發(fā)展，具有重要意義。因而血液凈化灌流技術(shù)引起了學(xué)者的關(guān)注[7]，近年國內(nèi)外通過血液灌流的方法直接清除血液中內(nèi)毒素，并在動物實(shí)驗(yàn)中取得一定效果[8]。本試驗(yàn)利用本課題組研發(fā)的親和吸附材料，制成一次性血液灌流器，來清除實(shí)驗(yàn)犬腸源性內(nèi)毒素，證明該材料對清除內(nèi)毒素的有效性及安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

普通級比格犬7只(雌性3只，雄性4只)，體重(10±2)kg，1～2歲齡，均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心【SCXK(軍)2012-0002】提供；無孕，在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心【SYXK(軍)2012-004】飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，實(shí)驗(yàn)按照實(shí)驗(yàn)動物3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 親和吸附材料及灌流器

本課題組由天津市陽權(quán)醫(yī)療器械有限公司研發(fā)低密度聚合物特異親和高分子吸附材料，制成一次性使用血液灌流器(DHC-II-340型)，該灌流器供本課題犬血液灌流使用。

1.1.3 主要器材和試劑

大型動物麻醉機(jī)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)ZS-M)心電監(jiān)護(hù)儀(深圳邁瑞 ipM12)異氟烷(河北一品制藥)氯安酮 胃復(fù)安 阿托品 鹽酸曲馬多 采血管(除熱源)ELX808酶標(biāo)儀(廈門鱟試劑生物科技有限公司)內(nèi)毒素檢測鱟試劑盒(廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司)DTX880酶標(biāo)儀(美國貝克曼)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 犬腸源性內(nèi)毒素模型建立

實(shí)驗(yàn)犬給予0.25 mL阿托品肌注并氯胺酮4 mg/kg加胃復(fù)安10 mg肌注誘導(dǎo)麻醉，仰臥位固定四肢，異氟烷維持麻醉，備皮消毒，腹中線開口，切開腹膜，在闌尾與盲腸處7號線結(jié)扎，使用7號針頭在闌尾上橫穿扎孔，針頭貫穿兩次，從針孔處擠出少量腸內(nèi)容物，將盲腸放回腹腔，縫合。術(shù)中靜脈給予250 mL生理鹽水補(bǔ)液，術(shù)后10 mg/kg 肌注鹽酸曲馬多止痛，兩次，每次12 h。灌流結(jié)束后做闌尾切除術(shù)及相應(yīng)的術(shù)后處理。

1.2.2 灌流器肝素化處理

啟動血泵，生理鹽水300 mL + 肝素10 mg以100 mL/min的速度沖洗灌流器，排盡管道中的空氣，完成灌流通路的肝素化，最后生理鹽水250 mL + 肝素50 mg在灌流通路中閉式循環(huán)10 min后備用。

1.2.3 血液灌流治療

鈍性分離實(shí)驗(yàn)犬右側(cè)股動脈，連接灌流導(dǎo)管、血泵和灌流器，形成閉合體外循環(huán)通路。血泵提供動力，血液經(jīng)過灌流器后返回體內(nèi)。肝素12 mg /h泵入，結(jié)束前30 min停止使用。灌流2 h后，采用空氣回血法使血液流回犬體內(nèi)，縫合傷口。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 內(nèi)毒素檢測

在造模前和灌流開始(造模后24 h)、灌流1、2 h抽血2 mL，用動態(tài)濁度法測定犬血液中內(nèi)毒素水平。內(nèi)毒素清除率計(jì)算方法：R(%)=(C0-Ct)/C0×100%，C0、Ct分別為內(nèi)毒素的初始濃度及t時(shí)間吸附后的濃度。

1.3.2 血常規(guī)、生化指標(biāo)檢測

造模前和灌流開始(造模后24 h)、灌流1、2 h抽血2 mL送往解放軍二五四醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測。造模開始前的所有指標(biāo)均視為基礎(chǔ)值。

1.3.3 生命體征監(jiān)測

造模前、造模后的4、12 h和灌流開始(造模后24 h)、灌流0.5、1、1.5、2 h測量犬的體溫、心率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 灌流后犬血液中內(nèi)毒素水平

灌流后犬血液中內(nèi)毒素水平：灌流開始(即造模24 h后)為(7.25±1.18)Eu/mL，灌流治療1、2 h后分別為(0.49±0.22)、(0.034±0.00)Eu/mL，與灌流開始比較，差異有顯著性(P<0.05)。灌流2 h后平均清除率R=99.52%。

2.2 灌流前后血常規(guī)指標(biāo)變化

造模后比格犬血液中的白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)、血小板(PLT)值均出現(xiàn)下降,如表1所示。灌流開始WBC、RBC、PLT與基礎(chǔ)值比較差異有顯著性(P<0.05)。灌流1、2 h后WBC、RBC、PLT與灌流開始相比，差異有顯著性(P<0.05)。血紅蛋白(Hb)灌流1、2 h后與灌流開始相比，差異無顯著性(P>0.05)。

表1 灌流前后犬血常規(guī)的變化Tab.1 Changes of the results of blood routine test in the dogs before and after perfusion(±s， n=7)

注: 與灌流開始比較，*P< 0.05。

Note. Compared with that at the perfusion begining,＊P< 0.05.

表2 灌流前后犬血液生化指標(biāo)的影響Tab.2 Blood biochemical indexes of dogs before and after perfusion(±s, n=7)

注:與灌流開始比較，＊P< 0.05。

Note. Compared with that at the perfusion beginning,＊P< 0.05.

2.3 灌流對生理生化指標(biāo)的影響

造模前后血液中總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、球蛋白(Glo)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素(Urea)、肌酐(Cr)、鉀(K+)、鈉(Na+)、氯(Cl-)、鈣(Ca2+)的水平如表2。由表2可知，造模后犬的TP、Alb、Glo下降。灌流治療1、2 h后血清TP、Alb、Glo指標(biāo)再次下降，與灌流開始相比差異有顯著性(P< 0.05)。造模后ALT值上升，灌流后逐漸下降。灌流1、2 h與灌流開始相比差異有顯著性(P<0.05)。造模后AST、Urea、Cr值下降，灌流1、2 h后含量進(jìn)一步下降，與灌流開始比差異有顯著性(P< 0.05)。電解質(zhì)各組間相比較及與基礎(chǔ)值比較,差異均無顯著性(P>0.05)。

2.4 實(shí)驗(yàn)過程中比格犬體溫和心率變化

由圖1，圖2可見，與基礎(chǔ)值相比，造模后比格犬體溫上升，心率加快。經(jīng)過灌流治療0.5、1、1.5、2 h后，體溫逐漸下降，心率減緩。灌流過程中比格犬的心率和體溫變化不大，趨于平穩(wěn)。

圖1 灌流前后比格犬心率變化Fig.1 Changes of heart rate in the beagle dogs before and after perfusion

圖2灌流前后比格犬體溫變化Fig.2 Changes of body temperature in the beagle dogs before and after perfusion

3 討論

近來隨著材料技術(shù)和免疫學(xué)的快速發(fā)展，吸附材料的發(fā)展也日新月異，醫(yī)學(xué)上所用到的吸附灌流材料也展現(xiàn)出不錯的前景[9-10]。與機(jī)體血液直接接觸的灌流吸附劑必須具備如下條件[11]：具有安全性無毒副作用且具有良好的血液相容性，理化學(xué)性能穩(wěn)定，易儲存消毒方便，要有可靠而明顯的療效。本課題組選擇親水單烯和疏水芳香雙烯單體制得“雙親性”大孔共聚物，再引入間隔臂將此共聚物與含大量氨基酸的配基相連制成“雙親型”親和吸附材料，這種吸附材料無毒、無味、可降解及良好的血液相容性，也能夠高效的清除血液中的內(nèi)毒素及內(nèi)毒素作用下機(jī)體產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)，并且能夠在使用中具有良好的穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灌流2 h后內(nèi)毒素平均清除率達(dá)到99.52%。說明吸附柱灌流治療能明顯的降低犬血液中內(nèi)毒素的水平。體現(xiàn)了灌流治療的有效性。造模后比格犬體溫上升，心率增快，灌流治療中體溫逐漸下降，心率減緩，趨于平穩(wěn)。造模后血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)下降，灌注后WBC、RBC、PLT繼續(xù)下降，可能是由于內(nèi)毒素本身引起的[12]，或是實(shí)驗(yàn)中大量補(bǔ)液導(dǎo)致，PLT下降還可能與使用肝素有關(guān)[13]，有待進(jìn)一步研究。灌流過程中TP、Alb及Glo均出現(xiàn)一定程度下降, 與灌流開始相比差異有顯著性(P<0.05)。原因有待進(jìn)一步研究分析。ALT在造模后升高，灌流后有所下降，AST、Urea、Cr造模后含量下降,吸附灌注后進(jìn)一步下降。灌流治療對內(nèi)毒素血癥比格犬電解質(zhì)影響甚微，各組間相比較及與基礎(chǔ)值比較,差異均無顯著性(P>0.05)。結(jié)果提示灌流治療內(nèi)毒素癥比格犬體內(nèi)WBC、RBC、Hb、PLT、ALT、AST、Urea、Cr指標(biāo)下降，但均未超出正常值范圍。以上說明灌流治療具有較好的血液相容性,安全性良好。

綜上所述，本課題所研發(fā)的親和吸附材料對血液中內(nèi)毒素有高效的清除作用且具有良好的血液相容性。能較好的處理戰(zhàn)地、地震等災(zāi)害中由燒傷、擠壓和嚴(yán)重感染等引發(fā)的內(nèi)毒素血癥，從而緩解病情挽救生命，同時(shí)也具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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