常若毅，呂嘉櫪，余芳

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

維生素是動物體和人類生命活動所必需的一類物質(zhì)，當(dāng)機(jī)體從外界攝取的維生素不能滿足其生命活動的需要時(shí)，就會引起新陳代謝功能的紊亂，導(dǎo)致生病甚至死亡[1]。維生素B1和維生素B6作為食品添加劑，同時(shí)又是營養(yǎng)強(qiáng)化劑，在調(diào)味品行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[2]。

國內(nèi)在乳酸菌產(chǎn)B族維生素方面的研究有報(bào)道，其中鄧麗、李龍柱、肖平等[3-5]研究表明定植于腸道中的益生菌能產(chǎn)生VB1，VB2，VB6等各種維生素；張開屏、李俊芳等[6,7]篩選鑒定了保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌等乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)VB6和VB12，其中VB6可達(dá)32.62 g/100 L。國外Le Blanc等[8]研究發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸性乳酸等為發(fā)酵劑時(shí)，增加了葉酸和視黃醇的產(chǎn)量；Hou等[9]研究表明雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌ST5、瑞士乳酸桿菌R0052為發(fā)酵劑時(shí)，提高了維生素B1的含量； Champagne等[10]研究發(fā)現(xiàn)

乳酸菌發(fā)酵豆奶，維生素B1或B6含量沒有明顯變化。

本文研究的是乳酸菌代謝產(chǎn)維生素。試驗(yàn)選用10株乳酸菌分別在MRS肉湯培養(yǎng)基、鮮牛乳培養(yǎng)基和蔬菜汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，研究它們在發(fā)酵過程中B1和B6的產(chǎn)量。對B族維生素進(jìn)行粗提等一系列操作，進(jìn)一步為復(fù)合維生素的食品添加劑和營養(yǎng)強(qiáng)化劑的研制提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 供試菌種

保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus，LB)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，LA)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，LP)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis，BL)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，LCR)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei，LCP)、糞鏈球菌 (Streptococcusfaecalis，SF)、嗜熱鏈球菌 (Streptococcusthermophilus，ST)、干酪乳桿菌 (Lactobacilluscasei，LC)、羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillusreuteri，LR)，由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物研究室提供。

1.2 試驗(yàn)原料

油麥菜、萵筍、芹菜、荸薺、菊芋，市售；鮮牛乳，市售，鮮牛乳符合國家標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.3 試劑藥品

甲醇(色譜純)、VB1標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)、VB6標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)、磷酸二氫鉀(分析純)、鹽酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)。

1.4 培養(yǎng)基配制

1.4.1 MRS液體培養(yǎng)基

牛肉膏 10 g，磷酸氫二鉀 2 g，蛋白胨 10 g，乙酸鈉 5 g，葡萄糖 20 g，檸檬酸二銨 2 g，酵母浸粉 5 g，七水硫酸鎂 0.58 g，硫酸錳 0.25 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水 1000 mL。

1.4.2 鮮牛乳培養(yǎng)基

將鮮牛乳分裝入?yún)捬豕苤校抗苎b15 mL左右，置于高壓滅菌鍋中滅菌，115 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫。

1.4.3 蔬菜培養(yǎng)基

分別選取5種蔬菜，除去雜物，徹底清洗干凈，使蔬菜和水的比例是2∶1，用打漿機(jī)榨汁，過100目篩，115 ℃滅菌15 min，備用。

1.5 儀器設(shè)備

1525-2487型高效液相色譜儀 美國Waters公司；DM750型LEICA數(shù)碼顯微鏡 北京瑞科中儀科技有限公司；QSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-3C型pH計(jì) 北京賽多利斯天平有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DH-360型電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司。

1.6 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法

1.6.1 菌種活化

將MRS液體培養(yǎng)基分裝入?yún)捬豕苤校抗苎b15 mL左右，置于高壓滅菌鍋中滅菌121 ℃，15 min，冷卻至室溫。然后接入菌種，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將火化后的菌種放于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 10株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中產(chǎn)VB1和VB6的研究

10株乳酸菌按1%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h時(shí)，離心，取上清液，測定VB1和VB6含量。

1.6.3 10株乳酸菌發(fā)酵鮮乳產(chǎn)VB1和VB6的研究

10株乳酸按1%的接種量接種到鮮牛乳培養(yǎng)基中，在37 ℃下靜置培養(yǎng)至凝乳，離心，取上清液，測定VB1和VB6含量。

1.6.4 10株乳酸菌發(fā)酵不同蔬菜產(chǎn)VB1和VB6的研究

10株乳酸菌按1%的接種量接種到不同的蔬菜中，在37 ℃下靜置培養(yǎng)48 h，離心，取上清液，進(jìn)行測定VB1和VB6含量。

1.7 VB1和VB6測定方法

VB1和VB6的測定采用高效液相色譜法[12]。

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

準(zhǔn)確稱取VB1和VB6標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 g于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度均為1 g/L的VB1和VB6標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.7.2 色譜條件

色譜柱：C18(配有紫外檢測器)，流動相：0.05 mol/L KH2PO4(pH 6.0)-甲醇(體積比85∶15)，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，波長：265 nm，進(jìn)樣量：20 μL。

1.7.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別配制質(zhì)量濃度為10～50 mg/L的2種維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在b所述的條件下進(jìn)樣測定，得到2種維生素的峰面積A與質(zhì)量濃度C(mg/L)的線性關(guān)系。

1.7.4 樣品處理

取5 mL發(fā)酵液，并加入40 mL的0.1 mol/L鹽酸超聲混合均勻。再用0.1 mol/L鹽酸定容至50 mL，超聲混勻后，靜置，離心后取上清液，獲得VB1和VB6的提取液，提取液過0.45 μm水系濾膜后上機(jī)測定。

1.7.5 標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

VB1和VB6標(biāo)準(zhǔn)品在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。

圖1 50 mg/L VB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高效液相色譜圖

圖2 50 mg/L VB6標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高效液相色譜圖

由圖1和圖2可知，在上述色譜條件下VB1的保留時(shí)間為2.804 min。VB6的保留時(shí)間為5.088 min。取VB1和VB6的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，分別配制10～50 mg/L質(zhì)量濃度梯度的2種B族維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在色譜條件下分別測定，選取以B族維生素濃度C(mg/L)為橫坐標(biāo)、以峰面積A為縱坐標(biāo)線性回歸，獲得回歸方程，見表1。

表1 VB1和VB6 的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

1.7.6 VB1和VB6混標(biāo)譜圖

圖3 VB1和VB6混合標(biāo)準(zhǔn)液高效液相色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 10株乳酸菌發(fā)酵MRS培養(yǎng)基VB1和VB6含量

以10株乳酸菌為發(fā)酵菌種，接種到MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結(jié)果見圖4。

圖4 10株乳酸菌發(fā)酵MRS培養(yǎng)基 VB1和VB6的含量

由圖4可知，10株乳酸菌發(fā)酵MRS培養(yǎng)基均產(chǎn)生VB1和VB6。其中，10株乳酸菌發(fā)酵液中VB1濃度在1.02～2.37 mg/L之間，VB6濃度在0.35～5.32 mg/L之間。ST發(fā)酵產(chǎn)VB1最大，為2.37 mg/L；LA發(fā)酵產(chǎn)VB6最大，為5.32 mg/L。

2.2 10株乳酸菌發(fā)酵乳VB1和VB6含量

以10株乳酸菌為發(fā)酵菌種，接種到鮮乳培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結(jié)果見圖5。

圖5 10株乳酸菌發(fā)酵乳VB1和VB6的含量

由圖5可知，10株乳酸菌發(fā)酵乳中均產(chǎn)生VB1和VB6。其中，發(fā)酵乳中VB1濃度在0.32～1.38 mg/L之間，VB6濃度在0.56～2.85 mg/L之間。LC發(fā)酵乳中VB1含量最高，為1.38 mg/L；LB發(fā)酵乳中VB6含量最高，為2.85 mg/L；10株菌在牛乳中發(fā)酵VB1產(chǎn)量小于在MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵，LB，BL，ST，SF在牛乳中發(fā)酵VB6產(chǎn)量高于在MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵。

2.3 10株乳酸菌發(fā)酵蔬菜VB1和VB6含量

2.3.1 10株乳酸菌發(fā)酵萵筍VB1和VB6的測定

以10株乳酸菌為發(fā)酵菌種，接種到萵筍培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結(jié)果見圖6。

圖6 10株乳酸菌發(fā)酵萵筍VB1和VB6的含量

由圖6可知，10株乳酸菌發(fā)酵萵筍中均產(chǎn)生VB1和VB6。發(fā)酵萵筍中VB1含量在9.13～10.34 mg/L之間，VB6含量在16.56～19.78 mg/L之間。LA發(fā)酵萵筍時(shí)，VB1含量最高；ST發(fā)酵萵筍時(shí)，VB6含量最高。10株乳酸菌發(fā)酵萵筍產(chǎn)VB1的量基本一致。乳酸菌發(fā)酵蔬菜汁比發(fā)酵鮮牛乳和MRS培養(yǎng)基中維生素產(chǎn)量高出很多。

2.3.2 10株乳酸菌發(fā)酵芹菜VB1和VB6的測定

以10株乳酸菌為發(fā)酵菌種，接種到芹菜培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結(jié)果見圖7。

圖7 10株乳酸菌發(fā)酵芹菜VB1和VB6的含量

由圖7可知，10株乳酸菌發(fā)酵芹菜中均產(chǎn)生VB1和VB6。10株乳酸菌發(fā)酵芹菜時(shí)，VB1含量在8.43～9.75 mg/L，VB6含量在13.78～17.39 mg/L。LCR發(fā)酵芹菜汁VB1含量最大；LA發(fā)酵芹菜汁VB6含量最大。10株乳酸菌發(fā)酵芹菜產(chǎn)VB1的量基本一致。乳酸菌發(fā)酵芹菜VB1，VB6含量都低于發(fā)酵萵筍VB1，VB6含量。

2.3.3 10株乳酸菌發(fā)酵油麥菜VB1和VB6的測定

以10株乳酸菌為發(fā)酵菌種，接種到油麥菜培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結(jié)果見圖8。

圖8 10株乳酸菌發(fā)酵油麥菜VB1和VB6的含量

由圖8可知，10株乳酸菌發(fā)酵油麥菜中均產(chǎn)生VB1和VB6。10株乳酸菌發(fā)酵油麥菜時(shí)，VB1含量在9.04～10.89 mg/L之間，VB6含量在16.72～20.31 mg/L之間。LA發(fā)酵油麥菜上清液中VB1，VB6含量都最大。10株菌發(fā)酵油麥菜VB6產(chǎn)量大于發(fā)酵芹菜的產(chǎn)量。除了菌種LCR，其余菌株發(fā)酵油麥菜產(chǎn)VB1的量均高于在芹菜中發(fā)酵的產(chǎn)量。

2.3.4 10株乳酸菌發(fā)酵荸薺VB1和VB6的測定

以10株乳酸菌為發(fā)酵菌種，接種到荸薺培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結(jié)果見圖9。

圖9 10株乳酸菌發(fā)酵荸薺VB1和VB6的含量

由圖9可知，10株乳酸菌發(fā)酵荸薺中均產(chǎn)生VB1和VB6。VB1含量在8.56～10.11 mg/L之間，VB6含量在13.28～17.44 mg/L之間。LC發(fā)酵荸薺時(shí)VB1含量最高；LA發(fā)酵荸薺時(shí)VB6含量最高。

2.3.5 10株乳酸菌發(fā)酵菊芋VB1和VB6的測定

以10株乳酸菌為發(fā)酵菌種，接種到菊芋培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結(jié)果見圖10。

圖10 10株乳酸菌發(fā)酵菊芋VB1和VB6的含量

由圖10可知，10株乳酸菌發(fā)酵菊芋均產(chǎn)生VB1和VB6。VB1含量在8.56～9.98 mg/L之間，VB6含量在13.43～17.87 mg/L之間。LA菌株發(fā)酵菊芋時(shí)，VB1和VB6都最高。LB，LC，ST，SF，LCR，LR在菊芋中發(fā)酵VB1的產(chǎn)量低于在荸薺中發(fā)酵的產(chǎn)量，ST，LCR，LR在菊芋中發(fā)酵VB6的產(chǎn)量低于在荸薺中發(fā)酵的產(chǎn)量，其余菌株VB6的產(chǎn)量高于在荸薺中發(fā)酵的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

10株乳酸菌發(fā)酵MRS培養(yǎng)基、鮮牛乳和5種蔬菜均產(chǎn)生VB1和VB6。10株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中的維生素B1含量在1.02～2.37 mg/L，維生素B6含量在0.35～5.32 mg/L；在發(fā)酵乳中的維生素B1的含量在0.32～1.38 mg/L，維生素B6含量在0.56～2.85 mg/L；在不同的發(fā)酵蔬菜汁中維生素B1的含量在8.43～10.89 mg/L，維生素B6的含量在13.28～20.31 mg/L。乳酸菌發(fā)酵蔬菜VB1和VB6的產(chǎn)量大于發(fā)酵MRS培養(yǎng)基和發(fā)酵乳的維生素產(chǎn)量。

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