劉新勃 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）孫嘉 吳少鵬 鞠孜敬 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東 泰安）唐德宏 （山東省泰安市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

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鴨圓環(huán)病毒的PCR鑒定及分子特點(diǎn)分析

劉新勃 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）孫嘉 吳少鵬 鞠孜敬 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東 泰安）唐德宏*（山東省泰安市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

本研究采用2對(duì)針對(duì)鴨圓環(huán)病毒(DuCV)的特異性引物，對(duì)57份病死鴨病料進(jìn)行PCR檢測，探究了DuCV在病死鴨的感染情況；同時(shí)，隨機(jī)選擇2個(gè)DuCV陽性的樣品進(jìn)行克隆、序列測定。結(jié)果顯示，病死鴨中DuCV陽性率為7.0%；同源性分析顯示，2株DuCV的核苷酸序列與廣西參考株(KC460535)的同源性最高，分別為97.7%、96%?；蜻M(jìn)化樹分析顯示，2株DuCV與德國參考株(AY228555)和廣西參考株(KC460532、KC460535)屬于同一群，為基因1型。本研究對(duì)病死鴨DuCV感染情況的初步調(diào)查，補(bǔ)充了其流行病學(xué)資料，對(duì)肉鴨疫病防控具有一定的參考意義。

鴨圓環(huán)病毒(DuCV) PCR鑒定 分子特點(diǎn)

圓環(huán)病毒是一種目前在哺乳動(dòng)物和禽類中發(fā)現(xiàn)和鑒定的最小的DNA病毒[1]，其在雞、鴨、鴿、鵝、豬等動(dòng)物體內(nèi)普遍存在[2-5]。圓環(huán)病毒有2個(gè)屬：圓環(huán)病毒屬和環(huán)病毒屬。雞傳染性貧血病毒歸于環(huán)病毒屬，豬圓環(huán)病毒、鸚鵡喙羽病、鴨圓環(huán)病、鵝圓環(huán)病等大部分病毒歸于圓環(huán)病毒屬。目前，對(duì)動(dòng)物的圓環(huán)病的研究主要集中在豬圓環(huán)病、雞傳染性貧血、鸚鵡喙羽病方面。

鴨圓環(huán)病毒最早于2003年由德國學(xué)者Hattermann通過PCR和電鏡從番鴨的法氏囊組織中發(fā)現(xiàn)[6]。2004年Soike等[7]研究發(fā)現(xiàn)，感染圓環(huán)病毒42日齡的半番鴨臨床上表現(xiàn)為羽毛紊亂、生長遲緩、體況消瘦，組織病理學(xué)檢測顯示，鴨法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞減少、法氏囊出現(xiàn)壞死、組織細(xì)胞增多，這與其他動(dòng)物圓環(huán)病毒引起的病毒誘導(dǎo)性淋巴組織損傷類似，由此推測該病毒可能具有免疫抑制作用。傅光華等[8]于2008年成功克隆了鴨圓環(huán)病毒的全基因序列。根據(jù)鴨圓環(huán)病毒的Cap蛋白，可將鴨圓環(huán)病毒分為兩個(gè)基因型：1型DuCV(Duck Circovirus Type 1, DuCV-1)和2型DuCV(Duck Circovirus Type 2, DuCV-2)。DuCV-1基因組大小一般大于1988bp，為1991bp，1995bp大小不等的基因組。兩個(gè)基因型的DuCV Cap蛋白基因在某些區(qū)域差異較大，是現(xiàn)行的DuCV分型方法。

近幾年來，對(duì)鴨、鵝等水禽僅呈隱形感染的疾病也可導(dǎo)致水禽死亡，一些曾經(jīng)免疫過禽流感疫苗的鴨也爆發(fā)流感，對(duì)此，很多研究者認(rèn)為是水禽感染了某種或某幾種能夠產(chǎn)生免疫抑制的病原，導(dǎo)致其機(jī)體免疫力下降，導(dǎo)致禽流感等病原體的繼發(fā)感染，其中圓環(huán)病毒是最重要的病原之一。鴨圓環(huán)病在臨床上主要表現(xiàn)為羽毛凌亂、生長發(fā)育緩慢、嚴(yán)重病例有時(shí)會(huì)出現(xiàn)零星死亡。但是由于發(fā)病癥狀不明顯，未得到相應(yīng)重視。盡管DuCV感染不具有明顯病征，但有研究證明，DuCV侵害鴨的免疫器官，引起潛在的免疫抑制和生長異常[6, 7]，從而使鴨對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答能力和其它病原的抵抗力下降，導(dǎo)致免疫失敗和繼發(fā)感染，增加疾病防治的難度，加重病情，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，因此，對(duì)DuCV進(jìn)行相關(guān)研究具有十分重要的意義。

山東地區(qū)是我國養(yǎng)殖較集中的地區(qū)，山東泰安地區(qū)水禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展較為迅速，為此，對(duì)山東泰安地區(qū)DuCV的感染情況進(jìn)行了初步調(diào)查，補(bǔ)充了其流行病學(xué)資料，并對(duì)毒株的核苷酸分子特點(diǎn)進(jìn)行分析，確定了山東泰安地區(qū)流行毒株的基因型，對(duì)肉鴨疫病防控具有一定的參考意義。

1 材料和方法

1.1 樣品 樣品來自山東地區(qū)的病死櫻桃谷鴨肝臟、脾臟共計(jì)57份，櫻桃谷肉種鴨場的死胚48份。

1.2 主要試劑 Tris 平衡酚購自Solarbio，瓊脂粉購自Biowest，2×Taq Master Mix(含Taq DNA Polymerase，dNTP，優(yōu)化的緩沖體系)購自諾唯贊生物科技有限公司，pUMD19-T載體購自Thermo Fisher Scientific，Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞購自Takara，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物信息 根據(jù)已發(fā)表的DuCV基因序列及文獻(xiàn)報(bào)道，選取兩對(duì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成。DuCV1：5’--TTACCGGCGCTTGTACTC--3’；5’--TACTTGTTTTCGGCGGGA--3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段長度為605 bp。DuCV2：5’--CATTACGCCATGGGCATG--3’；5’--CCAATAAACTACTGAGAC--3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段長度為1002 bp。

1.4 病毒基因組DNA提取 采用傳統(tǒng)苯酚氯仿法提取DuCV的基因組DNA。

1.5 PCR體系及條件 PCR反應(yīng)體系為25μl，2×Taq Master Mix 12.5μl，上下游引物各0.5μl，ddH2O 10.5μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

表1 DuCV參考株信息

1.6 PCR產(chǎn)物的鑒定 取7μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小進(jìn)行初步鑒定，瓊脂糖凝膠濃度為1%。利用凝膠回收試劑盒回收與目的片段大小相符的特異性片段，將基因片段連接至pUMD19-T載體，連接體系為：T4 DNA Ligase 1μl，pUMD19-T Simple Vector 1μl，10×Ligase Buffer 1μl，回收的PCR產(chǎn)物7μl。16℃過夜連接后轉(zhuǎn)化入Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落于LB培養(yǎng)液(Amp+)過夜培養(yǎng)，PCR鑒定陽性克隆送至鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.7 DuCV部分核苷酸序列分析 將測得的基因片段序列與DuCV參考株基因組序列比對(duì)，進(jìn)行同源性比較和基因進(jìn)化樹分析。用于核酸序列分析所用的DuCV各毒株名稱、GenBank登錄號(hào)、登錄時(shí)間、分離地區(qū)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測結(jié)果 提取病毒DNA，PCR擴(kuò)增后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像儀下可觀察到DuCV1引物擴(kuò)增出約605 bp左右的條帶(圖1A)，DuCV2引物條帶大小約為1002bp左右(圖1B)。PCR檢測結(jié)果顯示，病料中DuCV陽性率為7.0%(4/57)，未從鴨死胚中檢測出DuCV感染。

圖1 DuCV部分PCR檢測結(jié)果

A：DuCV 1引物，1-5為樣品，6為CEF陰性對(duì)照，7為DuCV陽性對(duì)照，M為DNA Maker 2000。B：DuCV 2引物，1-5為樣品，6為CEF空白對(duì)照，7為DuCV陽性對(duì)照，M為DNA Maker 2000。

2.2 DuCV部分基因序列同源性分析 隨機(jī)選擇PCR陽性樣品進(jìn)行克隆測序。序列分析發(fā)現(xiàn)，DuCV-A、DuCV-B的部分基因片段(605bp、607bp)同源性為98.3%。DuCV-A、DuCV-B的部分基因片段均與基因1型參考株(廣西，KC460535)的同源性最高，分別為97.7%、96%，與其它參考株的同源性分別在87.3%~97.7%、85.6%~95.9%之間(圖2)。由此可見，該試驗(yàn)檢測到的兩株DuCV與GeneBank中已發(fā)表的國內(nèi)外其它參考株的同源性較高，可確診為鴨圓環(huán)病毒。

圖2 DuCV部分基因片段同源性分析圖

2.3 DuCV部分基因片段系統(tǒng)基因進(jìn)化樹 基因進(jìn)化樹顯示，DuCV-A與DuCV-B位于基因進(jìn)化樹同一分支上，親緣關(guān)系極近。兩株DuCV與基因1型參考株(德國，AY22 8555；廣西，KC460532、KC460535)屬于同一群(圖3)。

圖3 DuCV系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

（1）DuCV最早在2003年由Hattermann從患病番鴨的法氏囊中檢測分離到，并進(jìn)行了全基因組測序[6]，隨后在福建、遼寧、中國臺(tái)灣、韓國、美國、匈牙利等地區(qū)也發(fā)現(xiàn)或報(bào)道該病毒[2, 8~10]。（2）DuCV感染主要引起羽毛發(fā)育不良，但是某些細(xì)菌、真菌以及多瘤病毒等其它病原感染引起的毛囊炎，代謝失衡、內(nèi)分泌病以及一些營養(yǎng)性疾病均能造成禽類羽毛發(fā)育不良，同DuCV感染的臨床表現(xiàn)相似。另外，由于DuCV感染鴨后很容易引起繼發(fā)感染，因此，在對(duì)DuCV進(jìn)行診斷時(shí)就要采用多種方法進(jìn)行鑒別診斷，也要考慮其它傳染性病原共感染的可能性。（3）現(xiàn)有的病毒增殖體系難以增殖DuCV，目前不能進(jìn)行病毒的分離，因此，DuCV的研究主要局限在檢測和基因組序列分析方面，各種蛋白分子生物學(xué)研究也難以找到合適的細(xì)胞系進(jìn)行。PCR在診斷DuCV方面的特異性和靈敏性已得到驗(yàn)證[7]。有研究報(bào)道，基于SYBR染料的熒光定量方法可用于法氏囊中DuCV的檢測[8]。除常規(guī)PCR和熒光定量PCR外，多重PCR、套式PCR、等溫環(huán)介導(dǎo)PCR在DuCV的檢測中也有相關(guān)應(yīng)用。另外，通過制備探針，利用ISH對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋的樣本進(jìn)行病理組織學(xué)檢測，間接ELISA和斑點(diǎn)雜交均是有效的檢測方法[2]。（4）本研究對(duì)2017年自泰安地區(qū)采集的病死鴨病料進(jìn)行DuCV的分離鑒定，發(fā)現(xiàn)DuCV在泰安地區(qū)鴨群有流行，但是大群健康鴨帶毒不發(fā)病。同時(shí)，也根據(jù)剖檢癥狀檢測了其它常見具有傳染性的病原體，包括禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)、H5、H7、H9亞型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)等病原進(jìn)行檢測，其它病原有陽性結(jié)果，但未檢測到DuCV與其它病毒同時(shí)感染的情況。另外，我們對(duì)PCR擴(kuò)增的片段測序后進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析，根據(jù)現(xiàn)行的DuCV分型方法分型發(fā)現(xiàn)，檢測到的DuCV主要為基因1型，確定了用于PCR擴(kuò)增的引物的準(zhǔn)確性和特異性。（5）李志國和劉少寧的檢測結(jié)果表明，DuCV在鴨中的感染存在不同的組織嗜性，雛鴨肝臟中的檢出率，胸腺和法氏囊的檢出率也較高，但脾臟檢出率存在爭議，可能與脾臟的發(fā)育程度有關(guān)[2,12]。Wan 等在2011年建立了檢測DuCV的熒光定量PCR方法，在進(jìn)行種蛋和死胚中的DuCV檢測時(shí)并未檢測到DuCV[13]，但李志國在某種鴨廠跟蹤檢測的過程中，在種蛋、死胚、和剛出殼的雛雞中均檢測到DuCV。（6）DuCV常以隱性感染的方式存在，養(yǎng)殖過程中通常不會(huì)對(duì)DuCV進(jìn)行檢測，這為DuCV的水平傳播創(chuàng)造了條件，DuCV會(huì)侵害鴨的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致鴨群更容易發(fā)生其它病原導(dǎo)致的疫情，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在對(duì)病死鴨進(jìn)行DuCV檢測的同時(shí)，也進(jìn)行了沙門氏菌的分離工作，結(jié)合臨床剖檢，發(fā)現(xiàn)感染DuCV的鴨更易發(fā)生細(xì)菌性繼發(fā)感染，引起病情的加重。隨著山東地區(qū)鴨飼養(yǎng)業(yè)的不斷發(fā)展，應(yīng)足夠重視DuCV的感染，避免DuCV感染加重疫情，減少損失，而針對(duì)DuCV的疫苗研制工作也急需進(jìn)行。

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(2017–09–01）

S852.65+9.2

A

1007-1733(2018)02-0005-03