包小萌 （山東省海陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 265100）張金勇 （新希望六和動(dòng)保中心 山東 青島）

?

豬流行性腹瀉病毒與豬流行性腹瀉

包小萌 （山東省海陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 265100）張金勇 （新希望六和動(dòng)保中心 山東 青島）

豬流行腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV)為尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronaviridae)成員，可造成新生仔豬的急性腹瀉、嘔吐、脫水等臨床癥狀并使新生仔豬呈現(xiàn)高死亡率；該病毒可引起育肥豬以及成年母豬腹瀉或是隱性感染。PEDV首先在歐洲發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，并迅速蔓延至亞洲，2013年美國(guó)暴發(fā)豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)，隨后加拿大、墨西哥等美洲國(guó)家相繼發(fā)現(xiàn)PEDV。豬流行性腹瀉發(fā)現(xiàn)以來(lái)，給流行區(qū)域的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本文章擬綜述PEDV的病原學(xué)特征、流行、診斷以及防治，以期對(duì)豬流行性腹瀉的防治提供依據(jù)。

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種傳染病，豬腹瀉是該病的主要癥狀，除此之外，仔豬會(huì)呈現(xiàn)嘔吐、厭食、脫水以及體重減輕等其它的臨床癥狀[1]。PEDV可感染各個(gè)年齡段的豬群，并表現(xiàn)不同的臨床癥狀；感染PEDV的仔豬經(jīng)常由于水樣腹瀉以及脫水而死亡，死亡率可高達(dá)80%~100%[2]。PED首次于1971年在英國(guó)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，1982年該病在亞洲國(guó)家首次報(bào)道并給養(yǎng)豬行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，2013年美國(guó)確認(rèn)了存在PED的流行并迅速傳播至加拿大、墨西哥等美洲國(guó)家[3]。豬流行性腹瀉的迅速傳播，已經(jīng)成為世界各國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)的潛在威脅，因此研究該病的病原學(xué)特征、流行特點(diǎn)、診斷方法以及有效的防治方法迫在眉睫。

1 豬流行性腹瀉病毒病原學(xué)特征

（1）PEDV為尼多病毒目冠狀病毒科成員，冠狀病毒科包括冠狀病毒屬、隆病毒屬。其中，冠狀病毒屬包括豬流行性腹瀉病毒、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)以及人呼吸道冠狀病毒等十余種病原；隆病毒屬目前僅有伯爾尼病毒、布里達(dá)病毒以及人類隆病毒等[4]。（2）PEDV為單股正鏈RNA病毒，呈現(xiàn)球形，直徑約95~190nm；有囊膜，囊膜表面有12~ 24nm纖突，纖突末端呈球狀，并且纖突有規(guī)則的排列為皇冠狀(附圖所示)。該病毒基因組全長(zhǎng)約為28kb，包含一個(gè)5’帽子結(jié)構(gòu)、3’腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu)，并由5’非編碼區(qū)，至少7個(gè)開放閱讀框(ORF1a、ORF1b、ORF2~6)以及3’非編碼區(qū)組成[5]；其中，ORF1a、ORF1b編碼病毒聚合酶，ORF3編碼結(jié)構(gòu)蛋白并且認(rèn)為該區(qū)域與病毒的致病性相關(guān)[6]；其他的開放閱讀編碼S，E，M，N蛋白[7, 8]。PEDV的蔗糖密度為1.18g/ml，對(duì)乙醚和氯仿敏感；該病毒在4~50℃和pH值為4~9范圍內(nèi)可穩(wěn)定存在；酸性或堿性消毒劑均可使該病毒失活[9]。（3）冠狀病毒可以侵蝕呼吸道以及腸道的上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，PEDV可侵入豬小腸絨毛上皮細(xì)胞并在其中復(fù)制[10]?，F(xiàn)已證實(shí)，豬氨基肽酶N(Porcine aminopeptidase N，pAPN)為小腸絨毛上皮細(xì)胞上PEDV的細(xì)胞受體。PEDV結(jié)合細(xì)胞上的pAPN并通過(guò)膜融合的方式將病毒的基因組釋放至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，病毒基因組在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、修飾、翻譯以及組裝成新的病毒粒子，病毒粒子經(jīng)胞吐的方式釋放至細(xì)胞外[3]。

附圖 PEDV結(jié)構(gòu)示意圖[3]

2 豬流行性腹瀉的近期流行狀況

（1）20世紀(jì)70年代，PED首次于英國(guó)報(bào)道，該病迅速蔓延至歐洲各國(guó)；在20世紀(jì)80~90年代，PED頻繁暴發(fā)，并且僅在斷奶仔豬以及育肥豬體現(xiàn)出腹瀉的臨床癥狀[11]。2005~2006年，在歐洲多個(gè)牧場(chǎng)可檢測(cè)到PEDV；而在2006年年中以及2007年年末，PEDV陽(yáng)性養(yǎng)殖場(chǎng)的PED病例逐步消失；2007~2014年，PED僅在PEDV陽(yáng)性場(chǎng)的各個(gè)年齡段的豬群呈現(xiàn)一過(guò)性感染，并且死亡率較低[12]。（2）在亞洲，日本于1982年首次報(bào)道PED流行，該病迅速傳播至毗鄰各國(guó)如中國(guó)、韓國(guó)等國(guó)家；隨后在各國(guó)不斷發(fā)生流行，在20世紀(jì)90年代，仔豬的死亡率由30%上升至100%；在21世紀(jì)初，該病傳播至菲律賓、泰國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣等國(guó)家和地區(qū)，并給當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[13]。2010年，在中國(guó)的部分省份出現(xiàn)了PED的大規(guī)模流行，并向西北地區(qū)的省份進(jìn)行蔓延；截至目前為止，中國(guó)至少含有29個(gè)省份存在PED的流行；2013年10月份，日本時(shí)隔7年再一次暴發(fā)PED，日本研究機(jī)構(gòu)分離出毒株并與已發(fā)表的毒株比較，發(fā)現(xiàn)該株病毒與美國(guó)和中國(guó)2013年暴發(fā)的毒株同源性極高[14]。2013年末，在韓國(guó)以及中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)也有相關(guān)PED暴發(fā)的報(bào)道[15]。（3）2013年4月，在美國(guó)的愛荷華州暴發(fā)PED，后經(jīng)研究人員分析，該病的病原與中國(guó)2011~2012年的一株病毒(China/2012/AH2012)同源性極高；該病迅速向其他州蔓延傳播，截止2014年9月份，已在包括愛荷華州、俄亥俄州、印第安納州等32個(gè)州的豬場(chǎng)發(fā)現(xiàn)PEDV[16,17]。PED自美國(guó)發(fā)現(xiàn)，迅速傳播至美洲其他國(guó)家，2013年7月，于墨西哥發(fā)現(xiàn)PEDV；2013年10月，秘魯首次確認(rèn)存在PEDV；2014年3月，古巴共和國(guó)發(fā)現(xiàn)PED病例；2014年4月，加拿大報(bào)道PED的流行；2014年9月，傳播至多米尼加共和國(guó)等等[18]。

3 豬流行性腹瀉的診斷

3.1 豬流行性病的臨床特征 （1）PED最主要的臨床癥狀為水樣腹瀉，所有日齡的豬均可感染發(fā)病，但是仔豬的發(fā)病率可高達(dá)100%。新生仔豬的小腸絨毛上皮細(xì)胞的更新時(shí)間為5~7d，1周齡以內(nèi)的仔豬常常持續(xù)腹瀉3~4d而脫水死亡，平均病死率為50%，有時(shí)可高達(dá)100%；日齡較大的仔豬在感染后的1周可恢復(fù)；育肥豬以及母豬可能會(huì)出現(xiàn)腹瀉的癥狀，主要表現(xiàn)為厭食和精神沉郁[4]。疾病開始發(fā)生至疾病轉(zhuǎn)歸的時(shí)間通常為3~4周，但在比較大型的養(yǎng)殖場(chǎng)中暴發(fā)流行PED，可能持續(xù)的時(shí)間還會(huì)延長(zhǎng)。（2）新生仔豬感染PED的臨床癥狀包括：精神沉郁、被毛粗亂、嘔吐腹瀉、脫水等；由于脫水的發(fā)生，仔豬很快死亡。感染PED的仔豬經(jīng)解剖肉眼觀察，可見明顯的病變。腹瀉早期，小腸內(nèi)可見大量的黃色液體并膨脹，腸系膜淋巴結(jié)腫大，小腸壁變薄；新生仔豬發(fā)生脫水時(shí)，于顯微鏡下觀察，可見小腸上皮形成空泡，嚴(yán)重者小腸上皮可脫落，小腸絨毛萎縮至原來(lái)的2/3，并且腸道內(nèi)酶活性顯著下降[19]。

3.2 豬流行性腹瀉的實(shí)驗(yàn)室診斷 （1）由于PED與傳染性胃腸炎(TGE)的臨床癥狀十分相似，臨床上經(jīng)常將二者混淆；隨著技術(shù)的進(jìn)步，可借助病毒分離、免疫組化、免疫熒光技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等實(shí)驗(yàn)室手段鑒定PEDV。（2）利用胰酶處理后的Vero細(xì)胞大大提高了分離PEDV的效率；而利用普通電鏡法也無(wú)法將PEDV與TGEV區(qū)分，因此科研人員選擇將PEDV與高免血清混合后離心，觀察到PEDV病毒粒子呈晶格狀排列[20]。（3）RT-PCR具有高明感性以及特異性，因此將其作為檢測(cè)病原的常用手段，科研人員根據(jù)PEDV基因組設(shè)計(jì)巢式PCR[21]，可用于PED的診斷以及流行病學(xué)調(diào)查。隨著技術(shù)的發(fā)展，修金生等利用熒光染料法(SYBR Green)建立起熒光定量PCR方法用以檢測(cè)PEDV，結(jié)果顯示，該方法靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)[22]；張志等優(yōu)化探針法(Taq-Man)建立起檢測(cè)PEDV的方法，為PED的快速診斷提供有效手段[23]。（4）ELISA作為一種簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法，可用于檢測(cè)抗原以及抗體。隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，膠體金技術(shù)成為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)PEDV的一種快速、有效的方法；由張利勃等建立的檢測(cè)PEDV的膠體金方法，為基層防疫檢疫人員提供便利[24]。

4 豬流行性腹瀉的預(yù)防和控制

4.1 流行性腹瀉疫苗 （1）疫苗是防控病毒傳播的最有效的手段，因此研究預(yù)防PED的有效疫苗刻不容緩。盡管歐洲最早流行PED，但是防控PED流行傳播的疫苗卻首先在亞洲研發(fā)成功。中國(guó)最早應(yīng)用CV777減毒或滅活疫苗來(lái)預(yù)防PED；日本在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代100多代后獲得了83P-5株減毒活疫苗。目前，在中國(guó)國(guó)內(nèi)主要以PED-RV-TGE三聯(lián)活疫苗為主預(yù)防PED，但仍繼續(xù)研發(fā)新型疫苗。（2）傳統(tǒng)疫苗主要為滅活疫苗以及減毒活疫苗。研究人員采用組織滅活疫苗免疫豬，結(jié)果證明免疫效果顯著，但是此種方法中滅活疫苗所產(chǎn)生的持久性保護(hù)效果不強(qiáng)，需多次免疫才可產(chǎn)生穩(wěn)定持久性保護(hù)效果，不利于大群免疫。自1988年P(guān)EDV分離技術(shù)成熟以后，研究人員使用Vero細(xì)胞對(duì)PEDV進(jìn)行培養(yǎng)；馬思奇等利用Vero細(xì)胞培養(yǎng)CV777株P(guān)EDV而制備成PED滅活疫苗；徐宏軍等在其基礎(chǔ)上制備了轉(zhuǎn)瓶工藝以及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝而制備CV777株P(guān)EDV滅活疫苗，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，該滅活苗免疫效果較組織滅活苗顯著提高，可有效的防控PEDV的流行[25]。但由于PEDV發(fā)生變異，致使抗原表位發(fā)生改變，因此CV777株P(guān)EDV滅活疫苗防控PEDV野毒株的能力減弱，因此新型有效的滅活疫苗亟待研發(fā)。截止目前為止，臨床上預(yù)防PEDV的疫苗為弱毒疫苗，其中以PED-RV-TGE三聯(lián)苗為代表，用以PED的防控。（3）隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，研發(fā)高安全性以及有效性的基因工程疫苗已經(jīng)成為一種趨勢(shì)。趙德等將PEDV的有效抗原基因片段(S片段)插入乳酸菌載體，成功構(gòu)建了乳酸菌載體疫苗，并通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證了該載體疫苗適用于口服，免疫后可產(chǎn)生較高效價(jià)的抗體；項(xiàng)林盛等通過(guò)雙酶切的方法將PEDV S1基因整合至重組腺病毒載體，包裝出可穩(wěn)定表達(dá)PEDV S1蛋白的重組腺病毒載體疫苗，為研制PED黏膜免疫疫苗奠定基礎(chǔ)。研究人員利用原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出PEDV含有抗原表位蛋白，并將該蛋白免疫動(dòng)物證實(shí)了蛋白具有免疫原性；但該方法成本較高，不適用于實(shí)際生產(chǎn)。以Suo為代表的科研人員利用Pvax1等載體構(gòu)建出表達(dá)有效抗原的DNA疫苗，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證，可產(chǎn)生較高水平的特異性抗體且血清可中和病毒[26]。

4.2 流行性腹瀉的控制 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理預(yù)防為PED流行的主要措施，發(fā)現(xiàn)感染PEDV的豬只盡早做隔離處理并進(jìn)行嚴(yán)格的消毒；哺乳仔豬感染PED后讓仔豬其自由飲水或人工補(bǔ)充水電解質(zhì)，防止仔豬因脫水而死亡。由于PEDV的傳播相對(duì)較慢，可采取相應(yīng)的預(yù)防措施預(yù)防該病毒進(jìn)入分娩舍，例如可將感染仔豬的帶毒排泄物接觸妊娠母豬，刺激妊娠母豬機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，此方法可推遲或減緩該病毒對(duì)仔豬產(chǎn)生感染或造成死亡，從而減輕經(jīng)濟(jì)損失。

5 小結(jié)

（1）在過(guò)去的20~30年中，PEDV已經(jīng)給亞洲以及歐洲的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而2013年，PED傳播至北美，迅速向美洲各國(guó)蔓延；PED已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)流行傳播疾病，嚴(yán)重制約著養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展。（2）因此，必須要進(jìn)一步研究PEDV的病原結(jié)構(gòu)、流行趨勢(shì)、診斷方法等，為研制預(yù)防該疾病的有效疫苗以及建立有效地生物安全措施提供依據(jù)。

[1] 殷震等. 動(dòng)物病毒學(xué)(第2版)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1997.

[2] Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets, China[J]. Emerging infectious diseases. 2012,18(1): 161-163.

[3] Lee C. Porcine epidemic diarrhea virus: An emerging and re-emerging epizootic swine virus[J]. Virology journal. 2015,12:193.

[4] 趙德明等. 豬病學(xué)(第10版)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2014.

[5] Kocherhans R, Bridgen A, Ackermann M, et al. Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus(PEDV) genome sequence[J]. Virus genes. 2001, 23(2): 137-144.

[6] Sun R, Leng Z, Zhai SL, et al. Genetic variability and phylogeny of current Chinese porcine epidemic diarrhea virus strains based on spike, ORF3, and membrane genes[J]. TheScientificWorldJournal. 2014, 2014: 208439.

[7] Jung K, Saif LJ. Porcine epidemic diarrhea virus infection: Etiology, epidemiology, pathogenesis and immunoprophylaxis[J]. Veterinary journal. 2015, 204(2): 134-143.

[8] Song D, Park B. Porcine epidemic diarrhoea virus: a comprehensive review of molecular epidemiology, diagnosis, and vaccines[J]. Virus genes. 2012, 44(2): 167-175.

[9] Hofmann M, Wyler R. Quantitation, biological and physicochemical properties of cell culture-adapted porcine epidemic diarrhea coronavirus (PEDV)[J]. Veterinary microbiology. 1989, 20(2): 131-142.

[10] Reguera J, Mudgal G, Santiago C, et al. A structural view of coronavirus-receptor interactions[J]. Virus research. 2014, 194: 3-15.

[11] Pritchard GC, Paton DJ, Wibberley G, et al. Transmissible gastroenteritis and porcine epidemic diarrhoea in Britain[J]. The Veterinary record. 1999, 144(22): 616-618.

[12] Sozzi E, Luppi A, Lelli D, et al. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and RT-PCR for the detection of porcine epidemic diarrhoea virus[J]. Research in veterinary science. 2010, 88(1): 166-168.

[13] Ayudhya SN, Assavacheep P, Thanawongnuwech R. One world--one health: the threat of emerging swine diseases. An Asian perspective[J]. Transboundary and emerging diseases. 2012, 59 Suppl 1: 9-17.

[14] ESFA Panel on Animal Health and Welfare (AHAW). Sci-entific opinion on porcine epidemic diarrhoea and emerg-ing porcine deltacoronavirus[J]. EFSA J 2014;12: 3877.

[15] Choi JC, Lee KK, Pi JH, et al. Comparative genome analysis and molecular epidemiology of the reemerging porcine epidemic diarrhea virus strains isolated in Korea[J]. Infection, genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases. 2014, 26: 348-351.

[16] Chen Q, Li G, Stasko J, et al. Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States[J]. Journal of clinical microbiology. 2014, 52(1): 234-243.

[17] Huang YW, Dickerman AW, Pineyro P, et al. Origin, evolution, and genotyping of emergent porcine epidemic diarrhea virus strains in the United States[J]. mBio. 2013, 4(5): e00737-00713.

[18] Song D, Moon H, Kang B. Porcine epidemic diarrhea: a review of current epidemiology and available vaccines[J]. Clinical and experimental vaccine research. 2015, 4(2): 166-176.

[19] 潘溪. 豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定與ELISA檢測(cè)方法的初步建立[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2015.

[20] 王繼科, 劉長(zhǎng)明, 馬思奇等. 豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉病毒的免疫電鏡診斷的研究[J]. 中國(guó)畜禽傳染病, 1991, 2: 22-25.

[21] 王金良, 謝金文, 沈志強(qiáng)等. 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄套式PCR檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2012, 39(9): 86-88.

[22] 修金生, 周倫江, 陳如敬等. 豬流行性腹瀉病毒SYBRⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2012, 42(2): 160-165.

[23] 張志, 劉自立, 董雅琴等. 豬流行性腹瀉病毒Taq-Man熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫, 2014, 31(4): 76-84.

[24] 張利勃, 周鐵忠, 王珅等. 豬流行性腹瀉膠體金抗體檢測(cè)技術(shù)的建立及其應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào). 2011, 27(3): 374-377.

[25] 劉政龍, 王金良, 沈志強(qiáng). 豬流行性腹瀉病毒研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2015, 42(9): 2506-2511.

[26] 蘇運(yùn)芳, 孫彥剛, 劉運(yùn)超等. 豬流行性腹瀉疫苗研究進(jìn)展[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2016, 48(2): 134-138.

（2017–10–10）

S858.28

A

1007-1733(2018)02-0069-03