金紅峰 曾廣忠 徐晨凱 王云龍 劉小偉 唐禮江

[摘要]目的通過微栓塞球聯(lián)合凝血酶粉制劑栓塞冠狀動脈制作Beagle犬急性心肌梗死模型的可行性以及安全性。方法選用體重10～12kg的30只Beagle犬經(jīng)股動脈行左冠狀動脈前降支造影，經(jīng)微導管先把聚乙烯微球2ml（4x104/ml）懸浮制劑快速注入，隨后注入凝血酶粉制劑2ml（1000u/ml）栓塞左前降支來建立心肌梗死模型。行心臟超聲檢查測量左心室舒張末內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末內(nèi)徑（LVEDs）、左心室射血分數(shù)（LVEF）等參數(shù)。結(jié)果

全部Bea-gle犬均行左冠狀動脈造影成功，栓塞即刻成功率為83.33%，術(shù)中死亡率為16.67%，2周的存活率為70.00%。術(shù)后1小時心臟超聲檢查提示心臟前壁心尖部、室間隔前1/3收縮減弱，LVEF值明顯下降。術(shù)后1周示左心室前壁出現(xiàn)節(jié)段性運動減弱及反向運動，LVEDd增大，LVEF值恢復正常范圍。結(jié)論微栓塞球聯(lián)合凝血酶粉制劑行冠狀動脈介入封堵法建立Beagle犬心肌梗死模型，具有建模成功率高、操作簡單快速、動物創(chuàng)傷小、術(shù)后恢復快及成活率高，且具有可逆性等優(yōu)點，是一種新型有效的犬急性心肌梗死造模方法。

[關(guān)鍵詞]心肌梗死模型；凝血酶粉；微栓塞球；冠狀動脈栓塞

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是常見的致命性疾病之一，隨著生活水平的提高，生活方式的改變，研究顯示心肌梗死的發(fā)病率逐年升高。在心肌梗死研究中，動物模型被廣泛用于發(fā)病機制和藥物手術(shù)治療研究。不同的動物模型制備過程適應不同的研究目的，心肌梗死動物模型的有效建立是完成相關(guān)實驗的前提。目前心肌梗死的造模方法多采用開胸結(jié)扎法和介入栓塞法。開胸結(jié)扎法創(chuàng)傷大，恢復慢。隨著冠狀動脈造影、經(jīng)皮冠狀動脈介入等技術(shù)日益成熟，為避免開胸手術(shù)建立模型，且達到同樣的效果，介入法建立心肌梗死模型的研究越來越多，本研究擬用微栓塞球聯(lián)合凝血酶凍干粉聯(lián)合栓塞冠狀動脈法建立beagle犬的急性心肌梗死模型，并通過手術(shù)前后冠狀動脈造影、實驗室檢查、心電圖、超聲心動圖等檢查驗證造模是否成功。

1材料及方法

1.1實驗動物：選擇10～13月齡健康普通級Beagle犬30只，體重10～12kg的（均購自上海新岡實驗動物場（許可證號：SCXK（滬）2012-0009），由浙江大學實驗動物中心飼養(yǎng)），雌雄各半。

1.2實驗儀器：C型臂x光機H5000：（荷蘭，Philips）；超聲多普勒診斷儀：（Philips Sonos 7500）；心電監(jiān)護（Prucka Enginerring公司的多導生理記錄儀器），Med-lab生物信號采集處理系統(tǒng)：（南京美易科技有限公司），心導管介入器械：BL 3.0 Guiding，F(xiàn)inecmss微導管、直徑為0.036cm的導絲（0.014 inch Runthmughguidewire）、泰爾茂5F多功能造影導管，泥鰍導絲（均為日本Temmo公司產(chǎn)品）、Boston 2.0x20mm預擴球囊。微栓塞球（聚乙烯微球X直徑90～125um）：美國Bangs Laboratories公司，凝血酶凍干粉（5000u）：浙江杭康藥業(yè)有限公司（H33021734），碘普羅胺注射液（優(yōu)維顯）：上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，戊巴比妥鈉：北京普博斯生物科技有限公司。

1.3 Beagle犬心肌梗死模型的建立：30只Beagle犬，術(shù)前禁食12h，禁水4h，用3%戊巴比妥鈉1ml/kg經(jīng)左前足前靜脈注射麻醉，控制靜推速度，應先快后慢，觀察犬反應程度“寧淺勿深”，根據(jù)實驗犬對刺激反應程度調(diào)整戊巴比妥劑量。將犬仰臥位固定于導管床上，并將頭部固定側(cè)向右側(cè)，保持呼吸道通暢，鼻導管吸氧（3L/min）。連接12導聯(lián)體表心電圖，記錄心電圖后，接模擬導聯(lián)Ⅱ行心電監(jiān)護。常規(guī)雙側(cè)腹股溝皮膚消毒、鋪巾。于右側(cè)股動脈搏動最強處用Seldinger法穿刺右側(cè)股動脈，置入Terumo橈動脈鞘。經(jīng)鞘管送入泥鰍導絲至主動脈竇底，沿導絲送入BL3.0 Guiding（日本Terumo公司產(chǎn)品）至左冠開口，左冠造影成功后，充分暴露前降支（1eft anterior desendingcoronary artery，LAD），以左頭位暴露最佳。將導絲成功送至前降支遠端，沿導絲送人Boston 2.0x20mm預擴球囊至LAD第二對角支處，以14arm擴張球囊，間隔30s分別先后行1、2、3min預缺血試驗，觀察心電監(jiān)護心率變化。撤出球囊，沿導絲送入Finecross微導管（日本Terumo公司產(chǎn)品），微導管至LAD第二對角支遠端，撤出導絲保留微導管在前降支位置不變，經(jīng)微導管先把微栓塞球2ml（4×104個/ml）快速注入，隨后經(jīng)微導管注入凝血酶粉制劑2ml（1000u/ml，用0.9%氯化鈉注射液配制）。觀察5～10min后行冠脈造影確認血流是否阻斷，如阻斷，間隔30min、1h、2h、3h、6h、12h復查冠狀動脈造影，了解血栓栓塞情況。1周后復查冠狀動脈造影，需重復以上冠狀動脈造影步驟，了解血管栓塞情況。結(jié)束手術(shù)后，拔出動脈鞘，穿刺口近端壓迫30min，并用彈力繃帶加壓包扎，每間隔1小時觀察穿刺點有無滲血血腫等。將實驗犬運回動物中心，注意保溫，待犬完全清醒后喂水，術(shù)后24小時解除穿刺點包扎，每日觀察犬精神狀態(tài)、進食量、穿刺處有無感染。

1.4心電圖檢查及心肌酶譜及肌鈣蛋白測定：于術(shù)后1小時、6小時、12小時、24小時行心電圖檢查，每次連接心電圖的位置固定不變，記錄體表12導聯(lián)心電圖（ECG），以觀察犬心肌梗死超急性期、急性期ECG變化。同時段經(jīng)前足靜脈抽取血液6ml分別裝于醫(yī)用常規(guī)管、生化管中，靜至30分鐘后，離心分離提取血漿、血細胞、血清保存至-80℃冰箱備用，由浙江醫(yī)院生化室分析儀測肌鈣蛋白I（cardiac tmponin，cTn-I）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）谷草轉(zhuǎn)氨酶（aLs.oartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（～jutamicpyruvic transaminase，GFF又稱ALT）。

1.5心臟超聲檢查：術(shù)前、術(shù)后1小時、6小時、12小時、24小時、3天、1周行心臟超聲檢查。取心臟四腔心及兩腔心切面用Simpson法檢測左心室射血分數(shù)（LVEF），取兩者平均值。取胸骨旁左心室長軸切面，測得舒張末期室間隔厚度（interventricular septal depth，IVSd）、左心室舒張末內(nèi)徑（1eft ventricular end diastolicdiameter LVEDd）、左心室收縮末內(nèi)徑（1eft ventricularend systolic diameter，LVEDs）；并根據(jù)LVEDd、LVEDs計算左心室短縮率（FS），所有數(shù)據(jù)測量3遍，并取3次平均值作為超聲心動圖最終數(shù)據(jù)。

1.6統(tǒng)計學處理：應用SPSS19.0版統(tǒng)計軟件，計量資料用（x±s）表示；手術(shù)前后的實驗室檢查指標及心功能指標采用配對t檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 Beagle犬心肌梗死模型的建立：全部Beagle犬均行左冠狀動脈造影成功，未行右冠狀動脈造影（圖1A見封三）。術(shù)中有4只犬發(fā)生室性心動過速，心室顫動，3只死亡，1只犬經(jīng)電除顫及抗心律失常治療成功救活。其中2只犬是微栓塞球和凝血酶制劑推注完后3～5min出現(xiàn)心率加快，經(jīng)多次除顫及利多卡因抗心律失常治療后仍未搶救成功，1只犬是在3小時復查造影時出現(xiàn)室性心動過速，心室顫動，同樣經(jīng)搶救無效死亡，只有1只犬搶救成功并直至實驗結(jié)束。2只犬在栓塞后出現(xiàn)心率逐漸減慢至30～40次/分，繼而血壓下降，經(jīng)阿托品、腎上腺素及異丙腎上腺素搶救無效死亡。因此術(shù)中3只犬死于室性心動過速，室顫，2只犬死于緩慢性心動過緩，一共5只犬術(shù)中死亡。其余的4只術(shù)后死亡的犬分別死于術(shù)后7h、13h、2d、7d，其中1例出現(xiàn)穿刺點血腫，解剖后可見雙側(cè)肺部淤血，考慮可能因急性心力衰竭或失血死亡，具體原因不明?？偟氖中g(shù)即刻成功25只，成功率83.33%，術(shù)中死亡5只，死亡率為16.67%，術(shù)后24h內(nèi)死亡7只犬，術(shù)后2周內(nèi)死亡9只犬（30.00%），2周的存活率為70.00%。所有犬因手術(shù)創(chuàng)口小均未出現(xiàn)創(chuàng)口感染。

冠狀動脈栓塞前完善左冠狀動脈造影；栓塞后30min、1h、2h、3h復查冠狀動脈造影提示LAD近端全閉，無血流通過，6h復查冠狀動脈造影提示近端血流再通，遠端管腔仍完全閉塞；12h及1周后復查冠狀動脈造影提示LAD血流再通，無明顯狹窄（圖1B、C、D、E、F見封三）。

2.2心電圖檢查：術(shù)前正常心電圖，犬的12導聯(lián)體表心電圖，可見心電圖所有導聯(lián)的ST-T段均在基線水平，犬左冠狀動脈前降支被堵塞后的12導聯(lián)體表心電圖中可見胸前導聯(lián)的ST段明顯抬高成弓背狀。肢體導聯(lián)上可見Ⅱ、Ⅲ、aVF導聯(lián)ST-T段無明顯抬高，其工、aVL導聯(lián)可見ST-T輕度抬高。

2.3心臟超聲資料：術(shù)前心臟超聲檢查示心臟收縮舒張功能及各階段運動正常（圖2A見封三），成功栓塞造成心肌梗死后可導致實驗犬急性心力衰竭發(fā)作，心臟超聲檢查提示EF值下降明顯，但術(shù)后3天后心功能開始恢復，至術(shù)后1周后EF值恢復正常范圍，見表1。術(shù)后1小時檢查提示心臟前壁心尖部、室間隔前1/3收縮減弱，EF值明顯下降（圖2B見封三）。術(shù)后3天檢查示：左室前壁出現(xiàn)節(jié)段性運動減弱，LVDd增大，二維圖像見左室腔擴大（圖2C見封三）。術(shù)后1周示左室前壁出現(xiàn)節(jié)段性運動消失及反向運動等現(xiàn)象，梗死區(qū)出現(xiàn)心肌強回聲，室壁變薄，LVEDd增大，EF值恢復正常范圍（圖2D見封三）。

2.4血生化檢查：Beagle犬栓塞后心肌酶譜及cTnI的改變與人類相似，在術(shù)后6h已明顯升高，12h左右達到峰值，24h后開始下降，符合心肌梗死的特點，見表2。

3討論

在疾病研究中，動物模型的開發(fā)與應用是研究疾病發(fā)病機制和治療手段的關(guān)鍵。隨著介入技術(shù)的日益成熟，經(jīng)心導管介入植入栓塞物或利用球囊等封堵冠狀動脈阻塞血流，定位栓塞冠狀動脈建立心肌梗死模型日益增多。介入封堵避免了開胸手術(shù)所造成的創(chuàng)傷，使死亡率明顯下降，是臨床研究心肌梗死比較理想的建模方法。

本實驗全部Beagle犬均行左冠狀動脈造影成功，微栓塞球聯(lián)合凝血酶粉制劑能成功地阻斷冠狀動脈前降支血流，且血栓能維持6h～12h。

和以往的不可逆相比較，本實驗的阻斷血流是可逆性的，不過結(jié)合心電圖、心肌酶譜、肌鈣蛋白以及心臟超聲等的結(jié)果，犬的心肌梗死是非常明確的。這也是一種新的心肌梗死模型。

成功栓塞造成心肌梗死后可導致實驗犬急性心力衰竭發(fā)作，呼吸心率加快，心臟超聲檢查提示LVEF值下降明顯，但術(shù)后3天后心功能開始恢復，至術(shù)后1周后LVEF值恢復正常范圍。同時心超提示術(shù)后心臟前壁及心尖部出現(xiàn)階段運動異常，1周后局部室壁瘤形成。血化驗提示心肌酶及肌鈣蛋白I較術(shù)前明顯升高，可以確定利用微栓塞球聯(lián)合凝血酶粉制劑行冠狀動脈栓塞法能成功建立心肌梗死模型。術(shù)中有3只犬發(fā)生室性心動過速、心室顫動死亡，2只出現(xiàn)心率減慢傳導阻滯死亡，4只死于術(shù)后2周內(nèi)，總的手術(shù)成功率83.33%，2周的存活率為70.00%。

凝血酶粉制劑是由凝血酶凍干粉經(jīng)0.9%氯化鈉注射液配制而成，臨床上多用于消化道出血、手術(shù)中不易結(jié)扎的小血管及外傷的止血。凝血酶粉是從牛血或豬血中提取的凝血酶原，經(jīng)激活而得的凝血酶。進入血管能導致血栓形成，但在預實驗時單就冠狀動脈內(nèi)注射凝血酶制劑較難形成血栓，實驗中顯示要平均注射15萬單位時冠狀動脈內(nèi)血栓才會形成。但先在冠狀動脈內(nèi)通過微導管注射微栓球使血流減慢后，再緩慢通過微導管定位注射同樣濃度的凝血酶粉制劑2000u就可使得冠狀動脈內(nèi)局部形成血栓。不能立即行冠狀動脈造影檢查，因凝血酶反應至形成穩(wěn)定血栓需要時間，觀察5～10min根據(jù)心電監(jiān)護上實驗犬的心率、心電圖ST段抬高，此時考慮冠狀動脈可能被完全閉塞。凝血酶凍干粉的特性需要直接與創(chuàng)面接觸，在損傷的內(nèi)膜上凝血效果比較好。使用球囊預擴張后，可導致局部的內(nèi)膜損傷，注射微栓塞顆粒可阻塞冠狀動脈微循環(huán)的作用，減慢血流，為凝血酶凍干粉注射形成血栓奠定基礎。前期的預實驗提示，如果單純只打凝血酶粉，反復注射3次～5次才能形成血栓，且量較大，副作用更大，而先注射微栓塞顆粒后，再注射凝血酶凍干粉后，只需要注射1次凝血酶凍干粉就可快速形成血栓。

綜上所述，微栓塞球聯(lián)合凝血酶粉制劑行冠狀動脈介入封堵法建立Beagle犬心肌梗死模型，具有建模成功率高、操作簡單快速、動物創(chuàng)傷小、術(shù)后恢復快及成活率高等優(yōu)點，且無需使用呼吸機，可廣泛應用于心肌梗死相關(guān)研究，極大地提高實驗進程。微栓塞球聯(lián)合凝血酶粉制劑封堵法是一種新型有效的犬急性心肌梗死造模方法。