熊忠亮，喬軍晶

(1.上海海事大學 商船學院，上海 201306；2.上海海事大學 海洋科學與工程學院，上海 201306)

流式細胞儀技術(shù)被廣泛應用于臨床醫(yī)學、細胞學、生物學、微生物學、制藥學、生殖學等領(lǐng)域，是現(xiàn)代科學研究中的先進儀器之一。20世紀90 年代初，隨著海洋科學的發(fā)展，流式細胞儀開始進入海洋生物學的研究范疇，應用于海洋浮游植物和海洋細菌的分類鑒定計數(shù)和生理生化研究以及海洋經(jīng)濟物種遺傳育種等方面，極大推動了海洋生態(tài)學和海洋實驗生物學的發(fā)展。

本實驗用流式細胞儀對水體中的活體微藻(異彎藻，塔胞藻)進行快速計數(shù)，探討流式細胞儀計數(shù)的正確性與可靠性。

1 目的

(1)通過對兩種不同藻進行流式細胞儀計數(shù)，驗證流式細胞儀是否只對水體中特定某種藻的微藻計數(shù)有效；

(2)通過對水體中低濃度活體微藻進行計數(shù)，驗證流式細胞儀是否可以計數(shù)血球計數(shù)板計數(shù)不到的低濃度；

(3)流式細胞儀在進行計數(shù)時，選用兩種熒光染色劑(PI和Viacount)分別計數(shù)，相比較說明流式細胞儀計數(shù)的準確性；

(4)用流式細胞儀對兩種微藻(塔胞藻和異彎藻)的混合液進行活藻計數(shù)，為流式快速計數(shù)水體中混合微藻奠定基礎(chǔ)；

(5)分別用流式細胞儀和血球計數(shù)板對處于對數(shù)期和衰亡期的微藻進行計數(shù)，驗證流式細胞儀是否較血球計數(shù)板更能準確地計數(shù)活的微藻。

2 實驗材料及方法

2.1 實驗儀器、試劑和材料

表1 儀器

表2 化學試劑

表3 實驗中所用的微藻(上海海洋大學)

2.2 試驗方法

2.2.1 微藻培養(yǎng)

2.2.1.1人工海水配置

取9 L自來水倒入水桶內(nèi)，滴入3～4滴殺菌除氯水，以消除自來水中次氯酸的影響。將300 g海鹽加入水桶內(nèi)，攪拌使海鹽溶解。 先用孔徑為120μm的中速定性濾紙對配制好的人工海水進行粗過濾，再使用孔徑為0.22μm的微孔濾膜進行細過濾，除去未溶解的雜質(zhì)顆粒。

2.2.1.2培養(yǎng)液配置

對赤潮異彎藻和塔胞藻使用F/2培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，其主要成分見表4。

表 4 培養(yǎng)液主要成分

2.2.1.3微藻的培養(yǎng)

將微藻接種于各自的培養(yǎng)液中，接種好的藻液放在恒溫光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)4～5 d至微藻生長狀況處于對數(shù)增長期。恒溫光照培養(yǎng)室培養(yǎng)條件： 26℃，晝夜光暗交替光照。

2.2.2 流式細胞儀計數(shù)

① 收集含藻培養(yǎng)液，其藻細胞數(shù)目約1×104～ 5×105個/mL，移入40 mL的離心管。

② 振蕩混勻后，從40 mL離心管中移取400μL的藻液至3.5 mL的樣品管，隨后加入380μL viacount試劑，振蕩混勻，4℃避光培育30min。

③ 取海水稀釋樣品指定倍數(shù)，用100μL的白色濾器過濾。

④將樣品管置于流式細胞儀中測量，流量設(shè)為2μL/s。

⑤流式細胞儀計算公式：藻細胞數(shù)/mL=細胞儀上顯示的活體微藻數(shù)/體積×1000×稀釋倍數(shù)

2.2.3 血球計數(shù)板計數(shù)方法

① 取1 mL的微藻懸液于小離心管中，加160μL 4%的戊二醛，靜置5min。

② 用血球計數(shù)板計數(shù)。

③計算公式:藻細胞數(shù)/mL=80小格內(nèi)微藻細胞個數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)

3 結(jié)果與分析

3.1 流式細胞儀計數(shù)精確度與準確度

用以Viacount為染色劑的流式細胞儀和血球計數(shù)板分別對同一濃度赤潮塔胞藻計數(shù)，觀察他們的平均值和相對標準偏差。結(jié)果如圖1所示。

處理前樣品溫度15℃，流式計數(shù)流量2 μL/s，Viacount用量為400μL，

過濾用50μm的黃色濾頭

圖1 用以Viacount為染色劑的流式細胞儀與血球計數(shù)板

對低濃度塔胞藻的計數(shù)

從圖1得出，兩者計數(shù)的平均值相差無幾，約為7.65×105#/mL，但從RSD(相對標準偏差)來看，在正常的計數(shù)范圍內(nèi)，流式細胞儀計數(shù)比血球計數(shù)板計數(shù)的精確度高。

為了再次說明流式細胞儀計數(shù)的準確性，選用了兩種染色劑(Viacount，PI)，來對低濃度塔胞藻進行流式細胞儀計數(shù)。結(jié)果如圖2。

處理前樣品溫度15℃，流式計數(shù)流量2μL /sec，Viacount用量為400μL，

PI用量200μL，過濾用50μm的黃色濾頭

圖2 分別以Viacount和PI為染色劑對低濃度塔胞藻

進行流式計數(shù)

由圖2得出，對于同一低濃度(約為1.7×103#/mL)塔胞藻的計數(shù)，Viacount和PI的計數(shù)結(jié)果相近。以Viacount為染色劑時的流式計數(shù)的RSD比以PI為染色劑時的高，但兩者的RSD均小于3%，分別為2.79%和0.51%。

3.2 流式細胞儀計數(shù)對不同濃度塔胞藻計數(shù)的結(jié)果

流式細胞儀正常的計數(shù)濃度范圍是1×104～5×105cells/mL，為了驗證流式細胞儀能否準確以及精確地測出低于這個濃度范圍的低濃度微藻的濃度，設(shè)定105，104，103，102四個濃度梯度進行實驗。分別用以Viacount和PI為染色劑的流式細胞儀對稀釋過的微藻懸液進行計數(shù)并與理論濃度比較。其結(jié)果如圖3、4。

由圖3得出，流式細胞儀計數(shù)結(jié)果與理論結(jié)果相近。稀釋度為10時，計算值和測量值差異最大。原因可能是測稀釋液濃度時，移液槍取樣不均勻或振蕩不徹底以致樣品中微藻偏少。稀釋度為6、10、200的RSD均小于5%。稀釋度為2000時RSD在10%～15%之間，原因是稀釋度在2000時濃度在102數(shù)量級上，濃度太低，相對來說，RSD就增大。

處理前樣品溫度15℃，流式計數(shù)流量2μL/s，Viacount用量為400μL，

過濾用50μm的黃色濾頭。

圖3 以Viacount 為染色劑對不同濃度梯度的

塔胞藻進行流式計數(shù)

處理前樣品溫度15℃，流式計數(shù)流量2μL/s，PI用量200μL， 過濾用50μm的黃色濾頭。圖4 以PI 為染色劑對不同濃度梯度的塔胞藻進行流式計數(shù)

從圖4可得，用PI做染色劑時的計數(shù)結(jié)果與用Viacount做染色劑時的計數(shù)結(jié)果出現(xiàn)相同規(guī)律。各個稀釋度的計算值與實測值相差很少，說明在這種情況下流式細胞儀計數(shù)的準確度。稀釋度為10、100、200時RSD均小于2%，稀釋度為2000時相對標準偏差在15%左右。結(jié)合圖3，說明流式細胞儀計數(shù)用在對于不同濃度梯度塔胞藻的計數(shù)準確度和精確度都很好。

3.3 流式細胞儀對不同濃度異彎藻計數(shù)的結(jié)果

在3.2節(jié)討論了流式細胞儀計數(shù)在不同濃度塔胞藻上的應用，為了驗證流式細胞儀計數(shù)對于除塔胞以外的微藻也有同樣的準確度與精確性，選用了赤潮異彎藻對其進行以PI為染色劑的流式細胞儀計數(shù)。結(jié)果如圖5。

處理前樣品溫度15℃，流式計數(shù)流量2μL/s，PI用量200μL， 過濾用50μm的黃色濾頭。圖5 以PI 為染色劑對不同濃度梯度的異彎藻進行流式計數(shù)

由圖5可知，在不同稀釋度下，所有微藻懸液用流式細胞儀計數(shù)的RSD均小于2%，表明計數(shù)精確度均很高。且各個稀釋度下(10、20、40、200)的計算值與實測值之間差異較小，說明對于異彎藻，流式細胞儀計數(shù)的準確度和精確度都很好。結(jié)合3.2節(jié)，可知流式細胞儀計數(shù)法不僅對于低濃度塔胞藻可靠，對于低濃度赤潮異彎藻的計數(shù)效果同樣可靠。

3.4 流式細胞儀對混合藻計數(shù)的結(jié)果

海水中微藻的種類不是單一的，存在的微藻有很多種。為了讓實驗更具現(xiàn)實意義，選用塔胞藻和異彎藻的混合液作為研究對象。在混合之前，先用流式細胞儀測出所用塔胞藻和異彎藻的原始濃度，便于算出混合微藻懸液(有兩種混合方式，一種是塔胞藻∶異彎藻為1∶3混合，另一種是塔胞藻∶異彎藻為3∶1混合)的理論濃度值，實驗結(jié)果如圖6。

處理前樣品溫度15℃，流式計數(shù)流量2μL/s，Viacount用量為400μL， 過濾用50μm的黃色濾頭。圖6 以Viacount 為染色劑對兩種不同混合液進行流式計數(shù)

由圖6可知，不管塔胞藻與異彎藻以何種比例混合(1∶3、3∶1)，混合液的理論濃度與由流式細胞儀計數(shù)的濃度都很接近。且兩種不同混合藻液的測量RSD都很小，分別為0.85%和1.5%，表明流式細胞儀對混合微藻懸液進行計數(shù)是可靠的。

4 結(jié)論

4.1 流式細胞儀計數(shù)的準確度與精確度

用分別以Viacount和PI為染色劑的流式細胞儀對同一濃度赤潮塔胞藻進行計數(shù)，得出兩者的相對標準偏差卻均小于3%，且計數(shù)值與血球計數(shù)板計數(shù)值相近。再用以PI為染色劑的流式細胞儀對稀釋度分別為10、100、200、2000的赤潮塔胞藻進行計數(shù)，當稀釋度分別為10、100、200時，PI為染色劑的流式細胞儀RSD均小于2%，稀釋度為2000時相對標準偏差在15%左右，用以Viacount為染色劑的流式細胞儀進行計數(shù)也得出相似的結(jié)論。將測試對象改為異灣赤潮藻或者異灣赤潮藻與塔胞藻的混合懸液，其測量標準偏差均小于3%，說明流式細胞儀計數(shù)的準確度與精確度是可靠的。

4.2 流式細胞儀可計數(shù)各種濃度范圍內(nèi)的微藻

對于低濃度的活體微藻濃度，對不同濃度的塔胞藻進行計數(shù)。流式細胞儀計數(shù)在1×103～1×106的相對標準偏差基本在2%左右，最大不超過5%。在1×102誤差在15%左右。相比血球計數(shù)板正常范圍內(nèi)的RSD(10%～20%)，其結(jié)果更為可靠。

4.3 流式細胞儀可對不同藻類進行計數(shù)

選用低濃度異灣藻計數(shù)，在10，20，40，200的稀釋度下，所有微藻懸液用流式細胞儀計數(shù)的RSD均小于2%，說明流式細胞儀對低濃度活體微藻的計數(shù)不僅只對塔胞藻有效。所以流式細胞儀快速，準確并精確的計數(shù)水體中低濃度的活體微藻對不同微藻都適用。

4.4 流式細胞儀可對藻類混合藻進行進行計數(shù)

用流式細胞儀對不同比例的塔胞藻和異彎藻的混合藻液(1∶3和3∶1)進行計數(shù)，理論值和計數(shù)值相差不大，RSD均小于

2%。從而說明流式細胞儀可用于在混合藻類計數(shù)。

[1]涂 波,曹 敏,黃 茜,等.分光光度法與顯微計數(shù)法測定微小綠藻生物量的比較研究[J].西南大學學報:自然科學版,2014,36(8) :44-50.

[2]陳慧婷,陶 益,朱 佳,等.藻細胞計數(shù)及死/活分析的流式細胞儀方法[J].深圳技術(shù)學院學報,2013,12(1):23-27.

[3]郁 晞,姚新民,黎桂福,等.淀山湖地區(qū)藻類細胞計數(shù)及微囊藻毒素污染現(xiàn)況調(diào)查[J].石油學報,2016,26(1):74-78.

[4]馮道倫,許樂平.船舶壓載水中生物取樣和檢測的幾個問題[J].環(huán)境科學與技術(shù),2009,32(3):87-89.

[5]Fuchs B M,Zubkov M V,Sahm K,et al.Changes incommunity composition during dilution cultures of marine bacterioplankton as assessed by flow cytometric and molecular biological techniques[J]. Environ Microbiol,2000,2(2):191-201.

[6]Karina Y G,Sallie W C,Robert J O. Seasonal and depth variation in microbial size spectra at the Bermuda Atlantic time series station[J]. Deep-Sea Res Pt I,1999,46:1221-1245.