芮 靜， 劉 英， 趙長山

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

野慈姑(SagittariatrifoliaLinn.)別稱狹葉慈姑、三腳剪、水芋，多年生水生或沼生草本，為慈姑的變種，與慈姑相比，野慈姑植株較矮，葉片較小、薄。苗期為4～6月，花期為夏秋季，果期為秋季。塊莖或種子繁殖，分布于全國各地。野慈姑為水稻田常見雜草，北方部分水稻種植區(qū)，有時發(fā)生較重。吡嘧磺隆為水稻田常用除草劑，可以防除1年生和多年生闊葉雜草與莎草科雜草，如野慈姑，最適宜施藥時期是水稻的苗后早期。

乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，簡稱ALS)主要存在于高等植物的葉綠體基質(zhì)中，是除草劑吡嘧磺隆的作用靶標(biāo)。ALS活性下降能阻礙支鏈氨基酸、蛋白質(zhì)的合成，影響植物細(xì)胞有絲分裂，同時導(dǎo)致植物組織失綠、黃化，破壞植物正常生長，使植物逐漸死亡[1]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)是植物體內(nèi)的抗氧化酶，在保護(hù)生物膜系統(tǒng)免受活性氧傷害方面能發(fā)揮很重要的作用[1]。目前對這些酶活性在低溫、干旱、病蟲害等不利于植物生長的環(huán)境下發(fā)揮的保護(hù)作用報道很多[2-4]，也有試驗表明雜草種群SOD活性能反映雜草對除草劑的抗藥性。通過測定不同種群野慈姑的ALS活性、SOD活性和葉綠素含量，以期為研究吡嘧磺隆對野慈姑生理生化指標(biāo)的影響提供一定的理論依據(jù)，在酶水平上初步探究野慈姑不同種群對吡嘧磺隆敏感性的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

于2014年春季在黑龍江省5個不同地區(qū)[雞東縣雞林朝鮮族鄉(xiāng)(H1)、鐵力市雙豐鎮(zhèn)衛(wèi)東村(H2)、寶清縣和平村(H3)、五常市志廣鄉(xiāng)范家屯(H4)、雞東縣石河村(H5)]的水稻田采集野慈姑球莖。

供試藥劑為10%吡嘧磺隆可濕性粉劑(日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會社)。

試驗儀器主要有VXE380超低溫冰箱(賽默飛世爾公司)、MR23i高速冷凍離心機(jī)(法國Jouan公司)、HWS-28電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、TU-1901紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試驗方法

采用室外盆栽法，于2015年5月30日從不同地區(qū)采集的野慈姑球莖播于塑料盆中，塑料盆直徑為15 cm，每盆播種8粒球莖，播深3～5 cm，正常水分管理，并于2015年6月4日(野慈姑播種后但即將出土前)用吡嘧磺隆進(jìn)行土壤封閉處理(9個)，施藥量分別為15、30、45、60、75、150、300、450、600 g a.i./hm2、，并設(shè)清水對照(CK)，共10個處理，每個處理重復(fù)3次。于施藥后7 d采取野慈姑挺水葉葉片為樣本，樣品取回后保存在-80℃的超低溫冰箱中待用。

1.2.1 乙酰乳酸合成酶活性的測定方法 參考隋標(biāo)峰的方法[1]測定乙酰乳酸合成酶活性。

1.2.2 SOD酶活性的測定方法 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium，簡稱NBT)還原法[5]，至反應(yīng)結(jié)束后，以不進(jìn)行光照的對照管作空白對照，分別測定其他各管在560 nm處的吸光度，SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為1個酶活性單位表示。

1.2.3 葉綠素含量的測定方法 采用80%丙酮溶液法[6]，將采回的葉片用自來水洗凈擦干后吸去葉表水分，稱0.2 g樣品進(jìn)行葉綠體色素提取。在分光光度計上測定葉綠素在波長為645、663 nm處的吸光度，然后根據(jù)以下公式分別計算葉綠素a、葉綠素b和葉綠素的總量：

葉綠素a濃度：Ca=12.72D663 nm-2.59D645 nm；

葉綠素b濃度：Cb=22.88D645 nm-4.67D663 nm；

葉綠素總濃度：Ct=Ca+Cb=20.29D645 nm+8.05D663 nm；

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

試驗原始數(shù)據(jù)均錄入Excel軟件后進(jìn)行統(tǒng)計、計算分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 吡嘧磺隆對乙酰乳酸合成酶活性的影響

由圖1可知，在不同地區(qū)采集的野慈姑種群的ALS活性隨著吡嘧磺隆用量的增加整體呈下降趨勢。野慈姑種群H5的ALS活性下降幅度最大，說明吡嘧磺隆對種群H5的抑制作用最大，H2次之，對吡嘧磺隆最不敏感的為種群H1。

在75 g a.i./hm2吡嘧磺隆劑量下，種群H2的ALS酶活性最低，為54.80%，種群H1的ALS活性最高，為 70.35%，說明在此劑量下，種群H2對吡嘧磺隆最為敏感，種群H1對吡嘧磺隆敏感性較低；在 600 g a.i./hm2吡嘧磺隆劑量下，H5的ALS活性最低，為17.63%，種群H1的ALS活性最高，為53.41%，說明在此劑量下，種群H5對吡嘧磺隆最為敏感，而種群H1對吡嘧磺隆最不敏感。

2.2 吡嘧磺隆對超氧化物歧化酶活性的影響

由表1可知，未使用吡嘧磺隆進(jìn)行藥劑處理時，不同野慈姑種群自身SOD活性并不相同。SOD活性較高的是種群H1和H3，其次是種群H2，種群H4和種群H5的SOD活性相對偏低。

表1 吡嘧磺隆對不同野慈姑種群SOD活性的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著。

對野慈姑種群進(jìn)行施藥處理，能夠使其體內(nèi)SOD活性發(fā)生變化。吡嘧磺隆施藥量在15～75 g a.i./hm2范圍內(nèi)，種群H1體內(nèi)SOD活性與對照無顯著差異；施藥量在150～600 g a.i./hm2時，種群H1體內(nèi)SOD活性與對照差異顯著，體內(nèi)SOD活性有逐漸下降趨勢。吡嘧磺隆施藥量在15～75 g a.i./hm2范圍內(nèi)，種群H2與對照差異極顯著，體內(nèi)SOD活性呈波浪式變化。吡嘧磺隆施藥量在15～600 g a.i./hm2時，種群H3與對照未達(dá)到極顯著差異。種群H4在吡嘧磺隆施藥量15～60 g a.i./hm2范圍內(nèi)與對照無顯著差異；在施藥量75～600 g a.i./hm2范圍內(nèi)，與對照差異顯著(除 450 g a.i./hm2劑量外)。除吡嘧磺隆施藥量為 15 g a.i./hm2外，其他各處理的種群H5體內(nèi)SOD活性均與對照有極顯著差異。

吡嘧磺隆對野慈姑種群H1、H2體內(nèi)SOD活性影響較小，不同處理SOD活性水平相對較高，能在一定程度上減輕吡嘧磺隆對野慈姑的傷害；吡嘧磺隆對野慈姑種群H5體內(nèi)SOD活性影響較大，減輕吡嘧磺隆對野慈姑傷害的能力較弱；種群H3、H4體內(nèi)SOD活性在吡嘧磺隆施藥量較低時，能減輕對野慈姑的傷害，但在高濃度時，保護(hù)野慈姑的這種能力下降。

2.3 吡嘧磺隆對野慈姑葉綠素含量的影響

隨著吡嘧磺隆用藥量的增加，野慈姑葉片顏色逐漸褪綠黃化，嚴(yán)重時葉片向內(nèi)卷曲、莖顏色褪綠黃化，但不同野慈姑種群的葉片褪綠黃化程度不同。由圖2可知，施藥后7、15、21 d野慈姑體內(nèi)葉綠素含量隨吡嘧磺隆用量的增加整體呈下降趨勢。

施藥后7 d，除種群H4在吡嘧磺隆施藥量為15、30 g a.i./hm2，種群H5在吡嘧磺隆施藥量15 g a.i./hm2時的葉綠素含量高于對照外，其他處理的葉綠素含量均低于對照。與對照葉綠素含量相比，葉綠素含量下降最多的是種群H1，最少的是種群H4。

施藥后15、21 d，隨著施藥量的增加，不同種群的葉綠素含量整體均呈逐下降趨勢。施藥后15 d，與對照葉綠素含量相比，葉綠素含量下降最多的是種群H1，其次是種群H3，最少的是種群H4；施藥后21 d，與對照葉綠素含量相比，葉綠素含量下降最多的是種群H4，其次是種群H2，最少的是種群H1。說明吡嘧磺隆能夠在一定程度上降低種群葉片中的葉綠素含量，從而影響植物的光合作用。

3 結(jié)論與討論

ALS活性是鑒定雜草對ALS抑制劑產(chǎn)生抗性的重要生理生化指標(biāo)。崔海蘭在播娘蒿對苯磺隆的抗藥性研究中明確指出，與敏感種群相比，抗藥性種群的ALS對苯磺隆的敏感性下降，且抗藥性生物型的ALS 序列在相對于197位的脯氨酸上發(fā)生了突變[7]；Hwang等在研究抗ALS抑制劑的鴨舌草時明確指出，鴨舌草對其不敏感[8]。本研究結(jié)果表明，在施藥量為15～600 g a.i./hm2范圍內(nèi)，不同種群體內(nèi)ALS活性隨著吡嘧磺隆施藥量的增加而下降，下降幅度最大的是種群H5，其體內(nèi)ALS活性從86.04%下降到17.63%；降低幅度最小的是種群H1，其體內(nèi)ALS活性從98.24%降低到53.41%。

隨著吡嘧磺隆施藥量的增加，不同種群SOD活性變化幅度不同，種群H1自身SOD活性偏高，而種群H5自身SOD活性偏低。說明SOD活性的變化不是影響野慈姑產(chǎn)生抗性的主要因素。

施藥后7、15、21 d后，野慈姑體內(nèi)葉綠素含量基本呈下降趨勢，隨著時間的推移，吡嘧磺隆對野慈姑體內(nèi)的葉綠素含量抑制作用加大。

每年都會增加一定數(shù)量的抗藥性雜草，雜草的抗藥性問題應(yīng)得到密切關(guān)注[9-10]。在抗藥性雜草治理方面，應(yīng)多汲取前人的經(jīng)驗，除加強(qiáng)抗藥性雜草的檢測和抗藥性機(jī)制方面外，應(yīng)多注意除草劑的交替、輪換使用，延緩抗藥性雜草的發(fā)生，延長除草劑的使用期限等[11]。充分掌握雜草的生物學(xué)特性，使之與農(nóng)業(yè)耕作措施相結(jié)合，更能從根本上解決抗藥性雜草發(fā)生的問題。

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