楊玉霞， 陳雪飛， 張 美， 胡 平， 夏燕莉， 詹志來， 曹 柳，3

(1.四川省中醫(yī)藥科學院，四川成都 610041； 2.中國中醫(yī)科學院中藥資源中心，北京 100700； 3.四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院，四川成都 610072)

虎杖為蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.)的干燥根莖和根，性微苦，微寒，具有祛風利濕、散瘀定痛、止咳化痰的功效，臨床上主要用于關節(jié)痹痛、濕熱黃疸、經閉、咳嗽痰多、水火燙傷、跌打損傷、癰腫瘡毒等病癥的治療[1]，其主要有效成分為虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素等。其中，虎杖苷具有鎮(zhèn)咳、保肝、抗休克及抑制血小板聚集等作用[2-4]；大黃素有較廣泛的生物活性，具有抑菌、抗炎、免疫調節(jié)和抗腫瘤等作用[5-6]。《中華人民共和國藥典》中虎杖項下以大黃素、虎杖苷的含量作為虎杖的質量控制指標[1]。近年來，由于過度采挖，野生虎杖資源遭受嚴重破壞，因此人工栽培成為解決虎杖資源枯竭問題、滿足市場需求的有效途徑之一。

主成分分析法是將眾多指標性狀轉化為少數綜合指標的一種統(tǒng)計分析方法，將復雜問題通過降維方式變得簡單直觀，目前已被廣泛應用于果蔬品質評價因子的篩選和品質的綜合評價?；⒄染哂胸S富的遺傳多樣性，其經濟性狀尚待深入研究。有學者主要對虎杖的化學成分[7-12]、藥理作用[13-21]及臨床應用[22-27]等進行了研究，尚未有采用主成分和聚類分析方法綜合研究虎杖產量和品質的報道。本試驗以19份虎杖作為研究對象，通過主成分及聚類分析方法對其產量和品質性狀進行綜合評價，以尋求虎杖產量與品質評價的主要因素，為構建川產虎杖的產量和質量綜合評價體系提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來源于四川省樂山市、雅安市、廣安市、巴中市及重慶市等地，共19份，均為野生居群，經四川省中醫(yī)藥科學院舒光明研究員鑒定為虎杖(Polygonumcuspidatum)。樣品來源如表1所示。

表1 供試材料編號及來源

1.2 儀器與試劑

主要儀器有Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、UV-1800紫外可見分光光度計(日本島津公司)、電子分析天平(德國Sartorius BS110S型十萬分之一)、KQ2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、DHG-9140電熱鼓風干燥箱。

主要試劑有虎杖苷對照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-15051307)、大黃素對照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-15042711)，純度均大于98%；乙腈(批號：905904)、甲醇(批號：905900)均為色譜純，均購自美國天地有限公司；水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 田間試驗 2013至2015年在四川省樂山市犍為縣五四村虎杖試驗地進行試驗。試驗地之前種植的作物為玉米，地勢平坦，肥力均勻，壤土，土壤理化性質為pH值7.53，全鉀、全氮、全磷、有機質的含量分別為46.77、0.72、0.15、94.40 g/kg，速效氮、有效磷、速效鉀含量分別為154.40、56.27、184.35 mg/kg。采用隨機區(qū)組設計，重復3次，小區(qū)面積為3.6 m2(3.0 m×1.2 m)，株行距為40 cm×60 cm，共6行，每行4株，每小區(qū)共栽種24株，栽培及田間管理同大田生產中各項措施。2015年8月隨機取10株虎杖，考察株高、莖粗、主莖葉數、分枝數及單株產量(以單株根及根莖鮮質量計)等農藝性狀，并以平均值進行統(tǒng)計分析。

1.3.2 虎杖苷及大黃素含量的測定

1.3.2.1 色譜條件 色譜柱為Zorbax Eclipse C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～13 min，20%～40% A；13～22 min，40%～80% A；22～23 min，80%～20% A)；流速為1 mL/min；檢測波長為299 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

1.3.2.2 混合對照品溶液的制備 取虎杖苷和大黃素對照品適量，精確稱定，加入甲醇配制成含226 μg/mL虎杖苷、217 μg/mL大黃素的對照品溶液。精確吸取3 mL虎杖苷對照品溶液、2 mL大黃素對照品溶液于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得到混合對照品溶液。

1.3.2.3 供試品溶液的制備 精確稱取各產地0.1 g的虎杖粉末置于具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，精確稱定質量，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用甲醇補足減失質量，搖勻，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，得到供試品溶液。

1.3.2.4 線性關系考察 分別精確吸取0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0 μL大黃素對照品溶液注入液相色譜儀，按 “1.3.2.1” 節(jié)下色譜條件測定大黃素峰面積，以對照品進樣量(μg)為橫坐標(x)，以峰面積為縱坐標(y)進行回歸分析，得回歸方程：y虎杖苷=114 8.4x+54.279 0(r=0.999 8)；y大黃素=1 594.2x+0.340 1(r=0.999 9)，虎杖苷在0.018 1～3.616 0 μg、大黃素在0.004 3～0.868 0 μg內呈良好的線性關系。

1.3.2.5 樣品測定 取適量供試材料樣品，按“1.3.2.3”節(jié)中的方法制備供試品溶液，同時按“1.3.2.1”節(jié)中色譜條件測定，采用外標一點法計算虎杖藥材中虎杖苷及大黃素含量。

1.4 數據統(tǒng)計分析

利用Excel進行數據平均值、標準差及變異系數的分析；利用DPS 7.05軟件[28]進行相關、主成分及聚類分析；依據方差累計貢獻率≥85%的標準提取主成分，以各主成分對應的方差貢獻率作為權重，對主成分得分和相應的權重進行線性加權，構建川產虎杖居群的評價函數；主成分聚類分析按歐式距離類平均法進行系統(tǒng)聚類。

2 結果與分析

2.1 虎杖主要農藝性狀、虎杖苷及大黃素含量表現

由表2可以看出，虎杖不同居群間10個農藝性狀以及虎杖苷、大黃素含量的變異幅度較大。

表2 虎杖主要農藝性狀、虎杖苷及大黃素含量的表現

變異系數是衡量性狀表現的差異程度、變異范圍的量。供試材料12個性狀的變異系數存在明顯差異，變異系數由大到小排序為大黃素含量>虎杖苷含量>分枝數>莖葉鮮質量>冠幅>莖粗>主根粗>主根長>單株產量>側根數>主莖葉數>株高。大黃素含量、虎杖苷含量、分枝數、莖葉鮮質量的變異系數較大，均在25%以上，說明這些性狀選擇的潛力大，受環(huán)境影響較大。株高、主莖葉數、側根數的變異系數相對較小，均在15%以下，說明這些性狀由本身內在因素決定，受環(huán)境因素的影響較小。因此，改善環(huán)境，提高分枝數、莖葉鮮質量，進而提高單株產量以及大黃素、虎杖苷的含量是實現虎杖高產優(yōu)質的有效途徑。

2.2 虎杖主要農藝性狀、虎杖苷及大黃素含量的主成分分析

對虎杖主要性狀進行主成分分析，結果表明，前5個主成分的累計貢獻率為88.724%>85.000%(表3)，說明前5個主成分已基本包含了虎杖性狀的全部信息，可用前5個主成分對其進行綜合評價。第1主成分的特征值為3.736，貢獻率為31.134%。決定第1主成分的主要是株高、莖粗、主莖葉數、冠幅及單株產量，其載荷值均為正值，稱為株型產量因子。第2主成分的特征值為3.201，貢獻率為26.677%，決定第2主成分的主要是主根長、側根數，其次為主根粗，其載荷值均為正值，稱之為根型因子。第3主成分的特征值為 1.942，貢獻率為16.184%，起決定作用的是分枝數，稱為分枝因子。第4主成分的特征值為1.050，貢獻率為8.750%，起決定作用的為虎杖苷含量及莖粗，其載荷值為較大正值，稱為虎杖苷-莖粗因子。第5成分的特征值為0.717，貢獻率為 5.979%，起決定作用的是虎杖苷及大黃素含量，其載荷值均為正值，而單株產量的載荷值為較大負值，稱為優(yōu)質低產因子。

2.3 不同虎杖居群的綜合評價

以各主成分對應的方差貢獻率作為權重，對主成分得分和相應的權重進行線性加權，構建虎杖評價函數：F=0.311 3F1+0.266 8F2+0.161 8F3+0.087 5F4+0.059 8F5，計算各居群的綜合評價分值，分值越高表示該居群綜合評價越好。

表3 5個主成分的特征值、貢獻率、累計貢獻率及其特征向量

在主成分綜合統(tǒng)計結果基礎上計算出供試的19份虎杖的產量和品質的綜合評價得分(表4)。結果表明，在所有的供試材料中，來自重慶市奉節(jié)縣小寨天坑(材料19)的評價得分最高(1.992)，其次為材料15和材料10，其綜合評分均在0.700以上，材料7和材料9的評價得分均在-1.000以下，編號為2、3、18等8份材料的評價得分在-0.700～0.000內，來自成都市大邑縣出江鎮(zhèn)香桂村1組(材料7)的評價得分最低(-1.343)。

2.4 虎杖產量與品質性狀的聚類分析

根據不同產地虎杖居群產量與品質性狀，可將19份種質資源分成3類。由表5、圖1可以看出，材料19單獨成Ⅰ類，該類分枝數最多、主根長較長，其他性狀中等偏上，屬于高產優(yōu)質型材料。第Ⅱ類由3、4、7、18等9份材料組成，該類側根數最多，虎杖苷含量最高，株高、莖粗、主莖葉數、單株產量、大黃素含量等均最低，屬于矮稈低產型材料。第Ⅲ類由1、2、5、17等9份材料組成，此類材料株高、莖粗、主莖葉數、冠幅、莖葉鮮質量、單株產量、大黃素含量均最高，但虎杖苷含量最低，屬于高產高大黃素含量型材料。

表4 19份虎杖的產量與品質的綜合評價得分

表5 基于虎杖主要農藝性狀及虎杖苷及大黃素含量的分類

3 結論與討論

在所有的供試材料中，材料19的綜合得分最高，為 1.992；其次為材料15，綜合得分為0.936。但從產量而言，15號材料表現較優(yōu)，其單株產量較高、分枝數較多、莖葉鮮質量較高，虎杖苷與大黃素的含量也較高，值得進一步選育推廣。本試驗分析的是各農藝性狀對單株產量的結果，對于群體產量結果如何，還要進一步探討。

在各種問題的多指標分析中，指標的數量多又相互關聯，分析工作比較困難。多元統(tǒng)計的主成分分析是指在不損失或很少損失原有信息的前提下，將原來數量較多而且彼此相關的指標轉換為新的數量少而彼此獨立或不相關的綜合指標，從而簡化多指標分析[29]。很多研究表明，用主成分分析方法進行綜合評價是一種有效的方法[30-31]。本試驗采用主成分分析方法，將19份虎杖種質資源的10個農藝性狀和2個質量性狀簡化為彼此不相關的綜合指標(主成分)，即株型產量因子、根型因子、分枝因子、虎杖苷-莖粗因子和優(yōu)質低產因子，這5個主成分對總變異的累積貢獻率約達85.000%以上。從主成分綜合質量評價結果可以看出，3類虎杖種質資源均有各自不同的優(yōu)良特性，可從中選擇優(yōu)質種質資源并加以推廣，加快虎杖優(yōu)良品種的選育工作。

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