李志賢， 郭禮強(qiáng)， 孫清榮， 李 楠

(1.山東科技職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261053； 2.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041)

霉菌的鑒定和分類(lèi)在傳統(tǒng)上以形態(tài)和培養(yǎng)特征為主要依據(jù)，但霉菌的形態(tài)特征復(fù)雜，其形態(tài)研究也因沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)、共同的表述及具有較大的人為主觀性而經(jīng)常受到質(zhì)疑[1]。分子生物學(xué)是解決以上問(wèn)題的有效途徑之一，然而許多分子技術(shù)手段仍處于研究階段，只能部分取代常規(guī)的霉菌鑒定方法，作為用于形態(tài)學(xué)鑒定的一個(gè)有力補(bǔ)充，此外利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行真菌的分類(lèi)和鑒別在時(shí)間和金錢(qián)方面花費(fèi)較多，這是其最大短板。次生代謝產(chǎn)物是在霉菌正常生長(zhǎng)受抑制時(shí)才會(huì)大量產(chǎn)生的，由于霉菌代謝產(chǎn)物有一定的特異性[2]，通過(guò)其代謝產(chǎn)物，可以對(duì)其進(jìn)行一定的劃分，作為形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分類(lèi)的補(bǔ)充。

霉菌的存在是產(chǎn)生霉菌毒素的先決條件，但有霉菌污染并不一定會(huì)帶來(lái)霉菌毒素污染，二者存在緊密且必然的聯(lián)系，比如黃曲霉有產(chǎn)霉毒素的菌株和不產(chǎn)霉毒素的菌株，不產(chǎn)毒素菌株被用來(lái)作為有益菌對(duì)產(chǎn)毒菌株加以抑制，但二者從分類(lèi)學(xué)和分子生物學(xué)的角度比較，差異非常小，而如果從食品安全角度比較，產(chǎn)毒與不產(chǎn)毒菌株完全是兩個(gè)概念。霉菌代謝產(chǎn)物在一定條件下也可以相互進(jìn)行轉(zhuǎn)化，近年來(lái)國(guó)外有研究表明，雜色曲霉毒素在合適條件下可以轉(zhuǎn)化成黃曲霉毒素。目前，霉菌的檢測(cè)和分類(lèi)與真菌毒素的檢測(cè)從生物學(xué)和化學(xué)的兩個(gè)領(lǐng)域被嚴(yán)格區(qū)分開(kāi)來(lái)，各自被獨(dú)立進(jìn)行研究，忽視了其內(nèi)在的必然聯(lián)系和規(guī)律。Minto等報(bào)道，黃曲霉毒素其中一條合成途徑后部分為雜色曲霉素A→脫甲基雜色曲霉素→雜色曲霉素(ST)→O甲基雜色曲霉素(MST)→黃曲霉毒素B1(AFB1)[3]。本研究通過(guò)高分辨質(zhì)譜檢測(cè)到ST和MST毒素，而對(duì)于其前體脫甲基雜色曲霉素和雜色曲霉素A未檢測(cè)到，推測(cè)這2種次級(jí)代謝物含量很少或?yàn)榉前獯x物。過(guò)去，直接分析真菌培養(yǎng)基以確定是否存在霉菌毒素必然包括“目標(biāo)”分析，不可避免地假定能找到那種毒素，而高分辨質(zhì)譜提供了一種可能的新方法用于研究真菌產(chǎn)生毒素的行為，因?yàn)閮x器能測(cè)定在液相色譜分離中檢測(cè)到的任何組分分子、離子的精確質(zhì)量數(shù)，這些組分可以通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物的精確質(zhì)量數(shù)得以鑒定，在全掃描條件下具有靈敏度高和選擇性好的特點(diǎn)，適用于多種代謝物的同時(shí)檢測(cè)[4-6]。目前，國(guó)內(nèi)外缺乏利用高分辨質(zhì)譜法對(duì)霉菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行的研究，筆者所在課題組通過(guò)代謝產(chǎn)物提取培養(yǎng)，經(jīng)高分辨質(zhì)譜檢測(cè)篩查，通過(guò)代謝譜庫(kù)搜索，尋找其生物性標(biāo)志物并建立其指紋圖譜，對(duì)產(chǎn)毒曲霉有毒代謝物篩選和菌種類(lèi)鑒定提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀：Thermo Ultimate 3000-Exactive(美國(guó)Thermo公司)，配電噴霧離子源(ESI)；離心機(jī)：5810R型(Eppendorf公司)；氮吹儀：N-EVAP(Organomation Associates公司)；霉菌培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；高溫蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；純水機(jī)：Milli-Q(美國(guó)Millipore公司)；萬(wàn)分之一天平(Mettler AE163)；均質(zhì)器(IKA T25)；振蕩器(IKA MS1)；5 mL一次性注射器； 0.22 μm 針頭過(guò)濾器。

AFB1、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、青霉酸、曲酸均購(gòu)于Biopure公司；ST、MST購(gòu)于Sigma公司中性氧化鋁(Alumina-N)購(gòu)于上海五四化學(xué)試劑有限公司；石墨炭黑粉(GCB)、C18粉(ODS)、PSA粉和氨丙基粉(Cleanert NH2)購(gòu)于Agela Technologies Inc。

甲醇、乙酸乙酯、乙腈和甲酸均為色譜純，美國(guó)Biopure公司；PD液體培養(yǎng)基(霉菌培養(yǎng)基)：馬鈴薯去皮切塊，每 200 g 加入500 mL水，煮沸30 min。雙層紗布過(guò)濾至燒瓶中，加入20 g蔗糖，加水至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。

標(biāo)準(zhǔn)菌株：寄生曲霉(CGMCC3.124)，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

1.2 樣品處理

將冷藏菌種接種到PD液體培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)5 d，取培養(yǎng)液400 μL接種到裝有10 mL PD液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在28 ℃下培養(yǎng)9 d。使用移液器移取菌液3 mL到離心管中，13 000 r/min離心10 min，吸取上清液2 mL到干凈玻璃管中；加入6 mL乙腈(含1%甲酸)溶液，渦混均勻后于30 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑诓ＡЧ苤屑尤?.2 g ODS，用1 mL乙腈-水(3 ∶7，含0.1%甲酸)渦混定容，靜置1 min后取上清液經(jīng) 0.22 μm 的濾膜過(guò)濾，待上機(jī)分析。同時(shí)以空白PDA培養(yǎng)基重復(fù)以上方法作對(duì)照。

1.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相A：水-甲醇-甲酸(體積比 900 ∶99 ∶1)加5 mmol乙酸銨；流動(dòng)相B：甲醇-甲酸(體積比999 ∶1)。高效液相色譜(HPLC)使用反相C18柱，流動(dòng)相：A 0.1%甲酸水，B甲醇。梯度洗脫程序：0.0 min→1.0 min，5% B；1.0 min→6.0 min，5% B→30% B；6.0 min→11.0 min，30% B→60% B；11.0 min→16.0 min，60% B→98% B；16.0 min→18.0 min，98% B；平衡2.0 min。進(jìn)樣體積10 μL，流速 0.3 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 全掃描正離子模式，氣體溫度為350 ℃，干燥器流量為12 L/min，霧化器壓力為310.264 kPa，離子源為正離子，數(shù)據(jù)儲(chǔ)存方式為柱狀圖，質(zhì)量掃描范圍(m/z)為100～1 100。標(biāo)準(zhǔn)品參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 8種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品的參數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用XCMS開(kāi)放性軟件進(jìn)行色譜峰識(shí)別以及峰匹配，并采用主成分分析法(pnhcipal component analysis，簡(jiǎn)稱(chēng)PCA)對(duì)對(duì)照組和培養(yǎng)提取液組進(jìn)行模式識(shí)別。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

用于提取溶液中目標(biāo)組分的試劑一般為乙酸乙酯和異丙醇，本試驗(yàn)通過(guò)在空白培養(yǎng)基中添加目標(biāo)物提取后經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)的方法分別對(duì)乙酸乙酯、乙酸乙酯+異丙醇、乙酸乙酯+1%甲酸、乙酸乙酯+異丙醇+1%甲酸和乙腈+1%甲酸的提取效果進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MST回收率偏低，不適用于乙酸乙酯等有機(jī)溶劑提取(表2)。通過(guò)多次試驗(yàn)，最終選擇了乙腈+1%甲酸提取，各種代謝物的提取回收率均達(dá)到了86%以上，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 凈化條件的選擇

培養(yǎng)基基質(zhì)復(fù)雜，而常用的免疫親和柱和多功能凈化柱受真菌毒素化學(xué)性質(zhì)限制，通過(guò)基質(zhì)加標(biāo)的方法分別比較了226(Romer)、HLB(Waters)、Agilent多功能凈化柱、黃曲霉免疫親和柱(華安麥科)對(duì)真菌毒素或代謝物的回收率。結(jié)果表明，黃曲霉免疫親和柱只對(duì)黃曲霉類(lèi)有較好的回收，HLB固相萃取柱對(duì)真菌毒素及代謝物有較高的回收率，但凈化成本很高，見(jiàn)表3。本研究使用QuEChERS方法[7-8]，同時(shí)考察了Alumina-N、GCB、ODS、PSA、NH25種凈化粉對(duì)6種霉菌代謝物毒素的吸附回收率，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品加凈化粉經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)并計(jì)算回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ODS凈化回收率在91.3%～108.9%，凈化粉回收率較好，而其他凈化粉對(duì)6種毒素都有不同程度的吸附，結(jié)果見(jiàn)表4。通過(guò)對(duì)ODS凈化粉不同添加比例組合后凈化8種真菌代謝物的對(duì)比，確定了“1.2”節(jié)用量為最佳比例條件。

2.3 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜條件的選擇 采用1.8 μm色譜柱填料使得高效液相色譜在較高的流速下依然可以保持良好的分離效率，并節(jié)省分析時(shí)間，提高分析通量。考慮到質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)流量的耐受性，采用0.3 mL/min的流速能夠滿(mǎn)足分離要求并提高分析通量，同時(shí)可不經(jīng)分流將流出液直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于培養(yǎng)基這種復(fù)雜的霉菌代謝物樣本，等度洗脫很難達(dá)到滿(mǎn)意的效果，而梯度洗脫是一種較為理想的選擇。在試驗(yàn)中筆者采用空白基質(zhì)同法制備的樣品來(lái)考察梯度條件對(duì)于分離的影響。首先，采用線性梯度洗脫，即B液在10 min內(nèi)由0%線性變?yōu)?8%(10 min后為柱沖洗和柱平衡程序)，雖然超高效液相色譜(UPLC)有相對(duì)于HPLC更高的分離效率，但由于培養(yǎng)液中化合物的種類(lèi)和數(shù)量都非常多，分離效果達(dá)不到要求。將梯度洗脫時(shí)間延長(zhǎng)為20 min，分離情況以及檢測(cè)到峰的數(shù)量都有明顯的提高。進(jìn)一步將洗脫時(shí)間延長(zhǎng)為30 min，分離效果又有了提高，但17 min后色譜峰較少，可以進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化以縮短分析時(shí)間，通過(guò)梯度程序進(jìn)一步優(yōu)化將洗脫時(shí)間變?yōu)?8 min，平衡2 min，用于霉菌代謝物的分離分析，取得了較為理想的分離效果。良好的分離可以進(jìn)一步減少質(zhì)譜檢測(cè)的離子抑制效應(yīng)。

表2 不同提取試劑的提取效率 %

表3 不同凈化柱對(duì)多種代謝物回收率的影響 %

注：“NF”表示未檢測(cè)到。

表4 經(jīng)ODS、Alumina-N、GCB、PSA、NH2吸附 的8種真菌毒素回收率 %

對(duì)于培養(yǎng)基這種復(fù)雜體系而言，其掃描的色譜峰的數(shù)量非常多，若分析色譜保留時(shí)間的穩(wěn)定性差，直接對(duì)比空白樣品和培養(yǎng)液代謝物指紋圖譜來(lái)觀察代謝物的變化比較困難。采用開(kāi)放性軟件XCMS可以快速提取出有用的信息。模式識(shí)別的方法有賴(lài)于高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集的建立，即色譜峰的匹配。保留時(shí)間的恒定對(duì)于色譜峰的匹配是至關(guān)重要的因素。本試驗(yàn)考察了標(biāo)準(zhǔn)品中6個(gè)色譜峰在3次重復(fù)分析中保留時(shí)間的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示色譜保留時(shí)間的穩(wěn)定性較好。

任何代謝物的產(chǎn)生，在霉菌代謝合成中都有一個(gè)代謝途徑，也可能有旁路途徑或分支途徑，比如在黃曲霉毒素代謝中，雜色曲霉素B可以合成黃曲霉毒素B2，也可以氧化進(jìn)一步合成黃曲霉毒素B1；黃曲霉毒素G2和黃曲霉毒素B2a為同分異構(gòu)體，黃曲霉醇和黃曲霉B2為同分異構(gòu)體，黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素Q1為同分異構(gòu)體等，還有其他一些未知的代謝物，結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)類(lèi)似，要實(shí)現(xiàn)良好分離比較困難。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)(含0.1%甲酸)，有的峰形不好，分離度達(dá)不到要求。對(duì)甲醇-水流動(dòng)相進(jìn)一步調(diào)整，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，確定了前面所述流動(dòng)相比例以及梯度洗脫方法，應(yīng)用該方法基線平穩(wěn)，各成分能完全分離并得到好的響應(yīng)值。高分辨質(zhì)譜儀不需要對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行特殊優(yōu)化，可以采用通用質(zhì)譜條件，只需調(diào)整掃描質(zhì)量范圍即可?；衔锖Y選離子提取誤差小于5×10-6u。提取離子色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

2.3.2 質(zhì)譜條件的選擇 對(duì)于質(zhì)譜離子源，需要設(shè)置干燥氣的溫度、流量，霧化器的壓力，以及毛細(xì)管電壓等參數(shù)的數(shù)值。其中干燥氣的溫度、流速，霧化器的壓力還與流動(dòng)相的比例、流速以及待分析的物質(zhì)有很大關(guān)系。本試驗(yàn)中對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)毒霉菌的研究，是以產(chǎn)黃曲霉毒素為基礎(chǔ)的，根據(jù)黃曲霉毒素建立霉菌代謝產(chǎn)物標(biāo)志代謝產(chǎn)物及其指紋圖譜，不是檢測(cè)和建立其所有標(biāo)志性代謝產(chǎn)物，由于黃曲霉毒素在正離子條件下響應(yīng)值高，所以只是做了正離子全掃描，并且能得到很多的化合物信息，質(zhì)荷比范圍為100～1 100，減少了分析時(shí)間，所以本試驗(yàn)選用正離子掃描。脫溶劑氣流量以及溫度對(duì)代謝物的離子化效率有較大影響。以0.3 mL/min的流速泵入0.1%甲酸溶液，調(diào)整霧化氣流量以及溫度，觀察霧化情況，結(jié)果在脫溶劑氣流量為12 L/min、溫度為350 ℃的情況下噴霧效果較好并且穩(wěn)定。Q-Tof質(zhì)譜儀采用微通道板來(lái)檢測(cè)離子，增加微通道板電壓可以提高信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)也會(huì)影響其使用壽命。采用恒流泵恒速泵入?yún)⒈热芤?，?00 V為單位從1 800 V開(kāi)始逐步增加電壓，觀察m/z=322.048 1的峰的強(qiáng)度，直至增加100 V電壓時(shí)峰強(qiáng)度的增加幅度低于30%即為最優(yōu)電壓。通過(guò)優(yōu)化得到的微通道板電壓為2 500 V。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品掃描分析

代謝組學(xué)的核心問(wèn)題是通過(guò)一個(gè)對(duì)照組和試驗(yàn)組的等比性分析，比如用霉菌培養(yǎng)后純化的培養(yǎng)液作為試驗(yàn)組，用空白培養(yǎng)基作同等處理后作為對(duì)照組，通過(guò)它們之間的等比對(duì)照分析，去解釋它們之間的一些代謝物和代謝通路的差別，通過(guò)對(duì)代謝組的整體性分析，將這些代謝物產(chǎn)物與生物學(xué)特征、功能和疾病等相互關(guān)聯(lián)在一起。為便于分析研究，首先配制各濃度均為5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)高分辨質(zhì)譜掃描檢測(cè)，為保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和利于數(shù)據(jù)分析處理，標(biāo)準(zhǔn)品和空白樣品各掃描3次，保存模式為柱狀圖模式(Centroid)。用Metabolomics XCMS開(kāi)放性軟件處理，根據(jù)空白對(duì)照、精確分子量以及一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如P值<0.05等來(lái)減少雜質(zhì)分子的干擾，確定標(biāo)準(zhǔn)品參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。表5中的數(shù)據(jù)，是標(biāo)準(zhǔn)品和空白樣品經(jīng)高分辨質(zhì)譜掃描，經(jīng)XCMS軟件處理比對(duì)的結(jié)果。差異分3種情況，一種是標(biāo)準(zhǔn)品有而樣品沒(méi)有，即標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)質(zhì)譜掃描在特定位置出峰而空白樣品因沒(méi)有其化合物，則在同樣時(shí)間不會(huì)出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品一樣精確分子量的化合物峰；二是標(biāo)準(zhǔn)品和空白樣品在特定位置同時(shí)出峰；三是標(biāo)準(zhǔn)品在特定時(shí)間未出峰而空白樣品有顯著峰。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和空白樣品的差異變化我們可以把差異的后2種情況排除，從而快速得到標(biāo)準(zhǔn)品的特征性參數(shù)。通過(guò)表5中標(biāo)準(zhǔn)品化合物理論m/z與實(shí)際測(cè)量值相比較，偏差范圍不超過(guò)5×10-6u。應(yīng)用XCMS軟件的優(yōu)點(diǎn)是不需要人工對(duì)每個(gè)特征峰提取，經(jīng)軟件處理即可得到所有的特征峰參數(shù)，在樣品比對(duì)中會(huì)極大地節(jié)約時(shí)間，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品和空白樣品的比對(duì)，筆者可以確定方法的可行性，并可通過(guò)綜合掃描情況對(duì)其進(jìn)行整體分析。

2.4.1 總離子流圖比較 總離子流圖對(duì)比效果見(jiàn)圖2。

2.4.2 離子云圖比較 在試驗(yàn)比對(duì)中，通過(guò)XCMS軟件中的離子云(Cloud Plot)可以形象化一個(gè)二維數(shù)據(jù)集的分布，當(dāng)在有非常多的數(shù)據(jù)集合時(shí)對(duì)比明顯，使用內(nèi)置的例程在圖中軸線設(shè)置限制，并添加各點(diǎn)的數(shù)據(jù)，如圖3上半部分為空白樣品的Cloud Plot，橫坐標(biāo)為時(shí)間軸，縱坐標(biāo)為質(zhì)核比，綠色圓點(diǎn)為每個(gè)特異性離子。圖3下半部分標(biāo)準(zhǔn)品的Cloud Plot，可以很簡(jiǎn)單明了地弄清楚空白樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的差異。

表5 標(biāo)準(zhǔn)品掃描比對(duì)結(jié)果

2.4.3 主成分分析 主成分分析或者主元分析，是一種掌握事物主要矛盾的統(tǒng)計(jì)分析方法，它可以從多元事物中解析出主要影響因素，揭示事物的本質(zhì)，簡(jiǎn)化復(fù)雜的問(wèn)題。計(jì)算主成分的目的是將高維數(shù)據(jù)投影到較低維空間。對(duì)于一個(gè)由多個(gè)變量描述的復(fù)雜事物，人們難以認(rèn)識(shí)，如果事物的主要方面剛好體現(xiàn)在幾個(gè)主要變量上，人們只需要將這幾個(gè)變量分離出來(lái)，進(jìn)行詳細(xì)分析，PCA是可以用原有變量的線性組合來(lái)表示事物的主要方面的分析方法。本試驗(yàn)通過(guò)PCA圖譜分析，確定比對(duì)結(jié)果差異明顯，詳見(jiàn)圖4。

2.5 樣品掃描分析

基于液相色譜串連質(zhì)譜的非靶向代謝組學(xué)的研究流程一般分為3個(gè)部分：一是樣品準(zhǔn)備和數(shù)據(jù)采集；二是數(shù)據(jù)處理工具，本試驗(yàn)用XCMS數(shù)據(jù)處理；三是代謝物結(jié)構(gòu)鑒定。代謝組學(xué)目前主要應(yīng)用于早期疾病的診斷，如糖尿病診斷，以及發(fā)現(xiàn)疾病的代謝途徑、代謝通路、了解疾病的發(fā)生發(fā)展。本試驗(yàn)主要通過(guò)靶向代謝和非靶向代謝結(jié)合的方法，通過(guò)預(yù)測(cè)可能的代謝產(chǎn)物來(lái)對(duì)霉菌產(chǎn)毒代謝物的研究，了解其標(biāo)志性代謝物的產(chǎn)生及發(fā)展。按照“1.2”節(jié)樣品處理方法將樣品CGMCC 3.124經(jīng)Metabolomics XCMS開(kāi)放性軟件處理，根據(jù)空白對(duì)照、精確分子量和出峰時(shí)間等篩選CGMCC 3.124代謝產(chǎn)物的同時(shí)確定其菌種的指紋譜圖，并經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品確定，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品3.124掃描比對(duì)結(jié)果

表7 METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)檢索精確分子量347.076 4化合物及結(jié)構(gòu)特征

3 討論

霉菌代謝物眾多，對(duì)于非靶向代謝來(lái)說(shuō)，只通過(guò)有限的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)判定比較困難，又由于二次代謝物產(chǎn)量少，代謝物基質(zhì)復(fù)雜，目前沒(méi)有非常有效的提取純化方法，從而制約了通過(guò)高分辨質(zhì)譜二級(jí)離子掃描來(lái)篩查化合物。本試驗(yàn)通過(guò)大量的基礎(chǔ)資料收集以及文獻(xiàn)資料檢索，先確定黃曲霉毒素代謝物的產(chǎn)生途徑及各種可能的代謝產(chǎn)物，有針對(duì)性地對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)一步篩選，從而通過(guò)精確分子量搜索代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)初步對(duì)化合物分子式和名稱(chēng)進(jìn)行推測(cè)判定。比如篩查中提取到代謝物精確分子量347.076 4，通過(guò)代謝物譜庫(kù)搜索到6種可能的代謝物(表7)，結(jié)構(gòu)式推斷為C17H14O8，推測(cè)為黃曲霉毒素M2(AFGM2)、黃曲霉毒素G2a(AFG2a)或黃曲霉毒素B1二醇中的一種，由于代謝物含量很低，需要進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件和提高凈化方法來(lái)進(jìn)一步判定。

4 結(jié)論

本研究建立了一種產(chǎn)毒霉菌代謝物指紋譜庫(kù)的快速檢測(cè)方法，借助高分辨質(zhì)譜設(shè)備和代謝軟件以及代謝物譜庫(kù)，篩查霉菌有毒性標(biāo)志物并建立其指紋譜圖，可為霉菌分類(lèi)提供一定的補(bǔ)充，為篩查未知化合物提供一定的參考。

[1]繆承杜，洪 葵. 真菌分類(lèi)技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(22)：6695-6697.

[2]Carlile M J，Waikinson S. The fungi[M]. London：Academic Press，1994：482-490.

[3]Minto R E，Townsend C A. Enzymology and molecular biology of aflatoxin biosynthesis[J]. Chemical Reviews，1997，97：2537-2555.

[4]Tautenhahn R，Patti G J，Rinehart D，et al. XCMS online：a web-based platform to process untargeted metabolomic data[J]. Analytical Chemistry，2012，84(11)：5035-5039.

[5]Zhu Z J，Schultz A W，Wang J H，et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database[J]. Nature Protocols，2013，8(3)：451-460.

[6]Patti G J，Tautenhahn R，Rinehart D，et al. A view from above；cloud plots to visualize global metabolomic data[J]. Analytical Chemistry，2013，85(2)：798-804.

[7]董 靜，宮小明，張 立，等. QuEChERS-高效液相色譜法檢測(cè)蔬菜中的蚍蟲(chóng)啉，蟲(chóng)酰肼，阿維菌素和噻螨酮[J]. 分析試驗(yàn)室，2008，27(3)：91-94.

[8]史 娜，侯彩云，路 勇，等. QuEChERS-高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)食品中14種真菌毒素[J]. 食品科學(xué)，2014，35(16)：190-196.