梁慧娟， 閆 明， 李鈞敏

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041004； 2.浙江省植物進(jìn)化生態(tài)學(xué)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江臺(tái)州 318000； 3.臺(tái)州學(xué)院生態(tài)研究所，浙江臺(tái)州 318000)

目前，由于人類活動(dòng)(如采礦等)所帶來的土壤重金屬污染已經(jīng)成為全球環(huán)境污染治理的難題與焦點(diǎn)[1]。重金屬銅(Cu)既是植物光合作用、電子呼吸傳遞、蛋白質(zhì)代謝、抗氧化反應(yīng)等代謝過程所必需的元素，同時(shí)過量的銅又對植物生長和發(fā)育具有強(qiáng)烈抑制作用[2]。因此，尋找銅耐受或超積累植物已成為銅污染區(qū)域的植被恢復(fù)或修復(fù)的主要途徑之一[3]。

海州香薷(Elsholtziasplendens)為唇形科香薷屬的一年生草本植物，別稱“銅草”和“銅草花”，廣泛分布于我國的長江中下游地區(qū)。近年來的研究證實(shí)，海州香薷對銅具有較高的耐性和較強(qiáng)的累積能力，其根部銅含量高，在銅礦區(qū)生長異常旺盛，是礦區(qū)的優(yōu)勢種之一，為銅礦的指示植物，是一種有潛力的修復(fù)植物[4-6]。當(dāng)前較多研究集中在海州香薷對銅富集能力、光合作用、根系分泌物、銅結(jié)合蛋白質(zhì)等一些生理生化機(jī)制上，對其后代適合度影響的研究較少，尤其是有關(guān)海州香薷的適應(yīng)性進(jìn)化幾乎沒有研究涉及。

種子作為植物的后代，其形態(tài)是植物在長期進(jìn)化過程中對環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果[7]，它與種子數(shù)量、擴(kuò)散對策及幼苗競爭能力有密切關(guān)系，進(jìn)而影響植物適合度的大小[8]。種子萌發(fā)是植物最早接受重金屬脅迫的階段，也是評(píng)價(jià)植物重金屬耐性的重要指標(biāo)。在植物生長過程中，早期的幼苗大小是植物生存適合度的最主要指標(biāo)[9]，反映了子代幼苗建群的能力[10]。有學(xué)者等采用溶液培養(yǎng)的方法，發(fā)現(xiàn)海州香薷種子的發(fā)芽率隨著銅濃度的升高而先升后降，銅處理可以顯著抑制海州香薷胚根與胚軸的生長。目前尚未見通過多代培養(yǎng)試驗(yàn)來分析銅脅迫對海州香薷后代適合度影響的相關(guān)報(bào)道。

本研究以經(jīng)過連續(xù)2代重金屬銅脅迫的海州香薷種群和對照(同步培養(yǎng)2代，未經(jīng)過銅脅迫處理的海州香薷種群)種子為供試材料，分析銅脅迫對海州香薷后代種子大小、種子萌發(fā)率及幼苗生長的影響，以更深入地認(rèn)識(shí)該植物響應(yīng)銅脅迫的生長與發(fā)育規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2013年在湖北省紅安縣華河鎮(zhèn)的幾個(gè)自然村周圍，在無Cu污染的背景下，隨機(jī)采集相應(yīng)的海州香薷種子。于2014年5月上旬對種子進(jìn)行殺菌處理(0.5%次氯酸鈉)后放入48孔穴盤中萌發(fā)，待植物幼苗長至6葉苗齡時(shí)，取相似大小的幼苗進(jìn)行移栽，采用筐栽方法進(jìn)行重金屬馴化。培養(yǎng)基質(zhì)由泥炭土、河沙、蛭石按 6 ∶3 ∶1的比例混合而成，基質(zhì)均于121 ℃滅菌2 h。Cu處理為添加CuSO4(分析純)溶液(0.16 mol/L)至終濃度達(dá)1 000 mg/kg的土壤；對照(CK)添加等體積的無菌水，作為不添加Cu處理。處理后將土壤放在大棚中平衡1周后移栽海州香薷，每筐栽種80株。每個(gè)處理6次重復(fù)。于同年12月底收獲種子，備用。2015年5月開始參照2014年的方法對已收獲的海州香薷種子進(jìn)行第2次重金屬馴化，于同年12月底收獲二代試驗(yàn)種子，備用。

1.2 種子大小及形態(tài)分析

隨機(jī)抽取2個(gè)處理二代海州香薷種子各1 000粒，用精確度為萬分之一的天平稱其千粒質(zhì)量，每筐種子重復(fù)3次。再隨機(jī)選取10粒種子，均勻撒在Epson掃描儀的玻璃板上，掃描獲得圖像后，用SmartGrain軟件直接分析種子的形態(tài)指標(biāo)，獲得種子表面積、周長、長度、寬度和長寬比。

1.3 種子萌發(fā)試驗(yàn)

隨機(jī)抽取2個(gè)處理的二代海州香薷種子，用0.3%次氯酸鈉表面消毒20 min，用蒸餾水沖洗干凈后，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)(25 ℃、16 h光照+20 ℃、8 h黑暗)，用不同Cu2+濃度(0、5、20、100、250、500、1 000、2 000 μmol/L)溶液(主要成分為CuSO4·5H2O)處理9d。每個(gè)培養(yǎng)皿放置25粒種子，共3個(gè)重復(fù)。將處理后的種子以5×5的方陣形式整齊擺放在鋪有雙層濾紙的90 mm培養(yǎng)皿中，并添加等量的不同濃度的銅溶液，使濾紙完全濕潤，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)，于每天的固定時(shí)間統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)，當(dāng)胚根長度大于2 mm時(shí)計(jì)為萌發(fā)，并用移液槍統(tǒng)一補(bǔ)充適量銅溶液。在第3天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢，在第8天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.4 幼苗生長指標(biāo)測定

在第9天，用電子游標(biāo)卡尺和電子天平測量幼苗的胚軸長度、胚根長度、胚軸鮮質(zhì)量和胚根鮮質(zhì)量，并分別按以下公式計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等指標(biāo)[11]：

發(fā)芽率(Gr)=(∑Gt/N)×100%；

發(fā)芽勢(Ge)=3 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/N；

發(fā)芽指數(shù)(Gi)=(∑Gt/Dt)；

活力指數(shù)(Vi)=Gi×S。

式中：Gt為在t天的發(fā)芽數(shù)，粒；Dt為相應(yīng)的發(fā)芽時(shí)間，d；N為種子總數(shù)，粒；S為幼苗長度，mm。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較種群間各項(xiàng)指標(biāo)平均數(shù)間差異的顯著性(α=0.05)，采用Origin 8.5軟件輔助作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅脅迫對海州香薷種子形態(tài)及大小的影響

由表1可以看出，與對照相比，銅脅迫處理2代后海州香薷種子表面積、周長、長度和寬度均顯著低于對照種群，但種子長寬比與種子千粒質(zhì)量沒有明顯變化。

表1 銅馴化種群與無馴化種群海州香薷種子形態(tài)指標(biāo)及千粒質(zhì)量

注：表中數(shù)據(jù)格式為“平均值±SD”。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母者表示處理間存在顯著性差異(P<0.05)。

2.2 銅處理對不同種群海州香薷種子萌發(fā)的影響

由圖1、圖2可見，隨著銅濃度增加，2個(gè)種群的海州香薷種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)大致呈先升高后降低的趨勢，表明高濃度的銅處理可以顯著抑制海州香薷種子的萌發(fā)。不管是在哪個(gè)銅濃度下，2個(gè)海州香薷種群的種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和第3天的發(fā)芽勢均不存在顯著差異，但銅脅迫處理種群的種子活力指數(shù)始終明顯低于對照種群。

2.3 銅處理對不同種群海州香薷幼苗生長的影響

由圖3、圖4可以看出，隨著銅濃度的增加，海州香薷幼苗胚根和胚軸長度、鮮質(zhì)量先逐漸升高再逐漸降低，表明高濃度的銅處理可以顯著抑制海州香薷的幼苗生長。當(dāng)銅濃度為5、100 μmol/L時(shí)， 銅脅迫處理種群的胚軸長度顯著低于對照種群；但胚根長度在銅濃度為5、500 μmol/L時(shí)顯著高于對照種群。在銅濃度為5、20、100、250 μmol/L時(shí)，銅脅迫處理種群的胚軸鮮質(zhì)量要顯著低于對照種群，而在銅濃度為100、500 μmol/L時(shí)的胚根鮮質(zhì)量也顯著低于對照種群。

3 討論

種子萌發(fā)是健全的種子在充足的水分、適宜的溫度和足夠的氧氣等適宜條件下，能夠發(fā)芽并長成正常植株的能力。發(fā)芽率和發(fā)芽勢能較好地反映種子萌發(fā)的速度、整齊性，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)是種子萌發(fā)的綜合指標(biāo)，能更全面地反映種子萌發(fā)期耐受重金屬的能力[11]。植物幼苗生長快慢可以反映植物生長形態(tài)的特征，也可以反映植物后期的生長狀況[12]。重金屬對種子萌發(fā)的影響存在低濃度下的刺激效應(yīng)和高濃度下的抑制作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，不管是銅脅迫處理過的海州香薷種群的種子還是對照種群的種子，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚根和胚軸長度及鮮質(zhì)量在響應(yīng)不同濃度銅處理時(shí)均存在“低促高抑”的現(xiàn)象。過量的銅會(huì)對植物產(chǎn)生毒害，可降低植株的存活率、降低生物量、延遲開花和果實(shí)成熟時(shí)間以及籽粒的發(fā)育等[3]。魚小軍等發(fā)現(xiàn)，隨著銅濃度的增大，顯著抑制了7種豆科牧草種子的發(fā)芽及幼苗生長[14]。王丹等也證實(shí)，高含量銅對小白菜種子萌發(fā)、幼苗生長產(chǎn)生顯著抑制作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，1 000 mg/kg銅脅迫處理2代的海州香薷種群的種子表面積、周長、長度和寬度均顯著低于對照種群；不管是在哪個(gè)銅濃度下，銅脅迫處理種群的種子活力指數(shù)始終明顯低于對照種群；在銅濃度為5、100 μmol/L 時(shí)，銅脅迫處理種群后代的胚軸長度顯著低于對照種群；在銅濃度為5、20、100、250 μmol/L時(shí)，銅脅迫處理種群后代的胚軸鮮質(zhì)量要顯著低于對照種群；在銅濃度為100、500 μmol/L時(shí)，銅脅迫處理種群后代的胚根鮮質(zhì)量顯著低于對照種群。這些結(jié)果表明，1 000 mg/kg重金屬銅連續(xù)處理2代可顯著抑制海州香薷種子的發(fā)育、種子萌發(fā)及幼苗生長。李月靈研究也發(fā)現(xiàn)，銅處理可以推遲海州香薷的始花期、開花高峰期、終花期，縮短花期持續(xù)時(shí)間，使植物花序?qū)?、花序生物量、種子總數(shù)量、總質(zhì)量顯著下降[3]，從而降低了海州香薷后代的適合度。

重金屬會(huì)對生物產(chǎn)生的一定的影響，而生活在重金屬環(huán)境中的生物也會(huì)對重金屬產(chǎn)生一定的適應(yīng)性[16]。馴化在動(dòng)物與微生物研究中應(yīng)用較多。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物會(huì)在長期進(jìn)化中演變出耐受重金屬的多種響應(yīng)機(jī)制[17]。重金屬處理可以顯著降低種子千粒質(zhì)量[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，銅脅迫連續(xù)處理2代的海州香薷種群的千粒質(zhì)量與對照種群相似，表明銅脅迫處理2代后，海州香薷種子的成分組成可能發(fā)生了適應(yīng)性改變，雖然表面積變小，但質(zhì)量變化不大。本研究還發(fā)現(xiàn)，在銅濃度為5、500 μmol/L時(shí)，銅脅迫處理2年的海州香薷種群幼苗的胚根長度顯著高于對照種群，表明銅脅迫處理2代后，海州香薷幼苗會(huì)提高胚根長度以增強(qiáng)幼苗對外界養(yǎng)分的捕獲能力，從而減緩銅脅迫對后代生長的抑制作用[3]。后續(xù)研究將繼續(xù)增加培養(yǎng)代數(shù)，以進(jìn)一步確認(rèn)海州香薷對銅脅迫的快速適應(yīng)性進(jìn)化發(fā)生的可能性及機(jī)制。

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