范振海 邢時云 馮源

【摘要】目的：采用生物信息學方法篩選出肝癌的關鍵差異表達基因。方法：對GEO公共數(shù)據(jù)庫中獲取的四組肝癌和癌旁組織基因表達芯片數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，首先用R數(shù)據(jù)包中的limma程序分別對各數(shù)據(jù)集的差異表達基因進行初篩，再進一步應用Robust rank aggregation（ RRA）法篩選出四組數(shù)據(jù)集共同差異表達的關鍵基因。結果：通過篩選共獲得269個差異表達基因，其中上調(diào)基因76個，下調(diào)基因193個，篩選出的差異表達基因與現(xiàn)有文獻報道一致。結論：RRA法是一種對多組基因表達數(shù)據(jù)進行差異表達基因篩選的可靠方法。本研究篩選出的差異表達基因，有望對肝癌發(fā)生的機制研究、腫瘤標志物的篩選以及治療靶點的選擇提供參考。

【關鍵詞】肝癌;差異表達基因;穩(wěn)健排序整合;基因表達譜芯片

原 發(fā) 性肝癌（primary livercancer，PLC）是全世界第六位最常見的惡性腫瘤，也是導致人類死亡的第二大腫瘤。其中大約75%的肝癌發(fā)生在亞洲，僅中國就占全世界50%以上的腫瘤病例[1]。PLC患者預后差，美國平均五年生存率僅為14%[2]，而在欠發(fā)達國家患者的預后則更差。因此，深入研究PLC相關的發(fā)生發(fā)展機制將為肝癌的治療及預后提供臨床參考。

隨著基因組學領域的快速發(fā)展，PLC研究領域也出現(xiàn)重大的革新性改變。高通量測序技術的出現(xiàn)使大量的基因表達數(shù)據(jù)不斷涌現(xiàn)，使人們發(fā)現(xiàn)肝癌組織和細胞在特定狀態(tài)下的基因表達情況和關鍵基因變化規(guī)律提供了可能。另外，由于各個實驗室實驗條件不同、臨床樣本包含的人群種族差異以及芯片平臺的不同，大量的研究結果呈現(xiàn)出的結果也不盡相同。因此，尋找一種有效評價不同基因表達譜研究結果的方法具有重要的意義。

穩(wěn)健排序整合（ Robust rankaggregation，RRA）法是一種利用概率模型整合排序列表的方法。有研究將其用于整合多組芯片數(shù)據(jù)基因列表，取得良好的效果[3，4]。本研究中我們采用RRA法對四組肝癌和癌旁組織基因表達譜數(shù)據(jù)集中差異性表達基因中的關鍵基因進行篩選，旨在為臨床篩選肝癌發(fā)生、發(fā)展的相關分子標志物及藥物治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生物信息學分析涉及數(shù)據(jù)集GSE45267、GSE45436、GSE76427、GSE62232均來自美國國立生物技術信息中心公共數(shù)據(jù)平臺基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（ Gene Expression Omnibus， GEO）， 數(shù)據(jù)的研究類型均為Expression profiling byarray，種屬為人，芯片平臺除GSE76427是GPL10558外，其余均為GPL570（具體數(shù)據(jù)信息見表1）。

1.2 數(shù)據(jù)處理及差異基因分析

各原始數(shù)據(jù)集分別用R語言軟件包進行數(shù)據(jù)處理，通過RMA算法對原始數(shù)據(jù)進行背景校正、標準化及表達值計算。我們以P<0.05和log（差異倍數(shù)）>1為標準分別篩選出肝癌與正常組織的差異表達基因。

1.3 肝癌差異表達關鍵基因的篩選

將各數(shù)據(jù)集篩選出的差異表達基因用RRA法進行排序，篩選出差異表達的關鍵基因。

2 結果

2.1 差異表達基因的篩選

在P<0.05和log（差異倍數(shù)）>1的條件下，GSE45267、GSE45436、GSE76427和GSE62232分別得到了543、1176、394和1147個差異表達基因，上調(diào)基因分別為181、413、64和461個，下調(diào)基因分別為362、763、330和686個。繪制的差異基因表達火山圖如圖l所示。

2.2 Robust Rank Aggregation法篩選肝癌差異表達的關鍵基因

通過對四組數(shù)據(jù)集的差異表達基因篩選，共獲得269個差異表達基因（肝癌/癌旁正常組織），其中上調(diào)基因76個，下調(diào)基因193個。并分別將排名前10的上調(diào)及下調(diào)差異基因制作差異表達基因的熱圖（圖2）。

3 討論

隨著腫瘤分子醫(yī)學、高通量測序以及基因芯片技術的發(fā)展，越來越多的致病基因被發(fā)現(xiàn)，如何從浩如煙海、錯綜復雜的數(shù)據(jù)中篩選出關鍵致病基因作為判斷患者預后指標和臨床治療靶點，成為擺在醫(yī)學科學家面前的一個難題。為篩選可作為肝癌診斷的關鍵基因和治療靶點，本研究利用生物信息學分析方法對GEO數(shù)據(jù)庫下載的四組肝癌和癌旁組織生物芯片數(shù)據(jù)進行分析，分別篩選出肝癌組織與正常組織的差異表達基因，結果發(fā)現(xiàn)不同數(shù)據(jù)集篩選出的差異基因數(shù)量及種類排序都存在很大差異。這與國內(nèi)外其他研究結果類似[5-9]。提示針對肝癌基因芯片數(shù)據(jù)檢測，不同實驗人員、實驗條件和實驗對象可得出的結果存在很大差別，因此，采用一種統(tǒng)計方法篩選出這些實驗共同存在的差異基因，可能對發(fā)現(xiàn)肝癌關鍵的差異表達基因至關重要。

我們進一步通過RRA法共獲得269個差異表達基因，其中上調(diào)基因76個，下調(diào)基因193個。上調(diào)基因包含GPC3、ASPM、CAP2和KIF2 0A等，具體上講，GPC3是一種存在于細胞膜上的硫酸乙酰肝素糖蛋白，它參與調(diào)控細胞生長、繁殖、分化、遷移和粘附等生物學行為，主要表達于中胚層來源的組織，在成熟的組織中低表達或不表達。多項研究結果證實GPC3蛋白在肝癌組織中高表達，而在正常肝組織中不表達或表達量極低[10-13];ASPM也被用來作為肝癌血管侵襲性強、早期復發(fā)以及不良預后的指標[14];CAP2表達升高有望用于早期發(fā)現(xiàn)甲胎蛋白隱性的肝癌患者[15]，而KIF20A在肝癌患者中高表達也預示總生存期和無瘤生存期顯著縮短[16]。下調(diào)基因包含HAMP、CLECIB、FCN3和CLEC4G等。HAMP基因編碼的蛋白質(zhì)為鐵調(diào)素，在機體內(nèi)鐵平衡的調(diào)節(jié)中起到負性調(diào)節(jié)的作用，研究發(fā)現(xiàn)它在肝癌組織中低表達[17]，CLECIB是血小板相關的分子，與肝癌瘤內(nèi)出血相關，盡管其具體作用仍不清楚，但研究顯示它在肝癌組織中表達下調(diào)[18，19];另外，F(xiàn)CN3和CLEC4G基因在肝癌組織中也呈低表達[20，21]。

綜上所述，本文采用RRA法對四組肝癌基因芯片數(shù)據(jù)進行挖掘分析，篩選出肝癌與癌旁正常組織的關鍵差異表達基因，該研究有望為肝癌發(fā)生的機制研究、腫瘤標志物的篩選及治療靶點的選擇提供參考。在以后的研究中，仍需進一步的分子實驗加以驗證。

參考文獻

[l]McGlynn KA， Petrick JL， LondonWT. Global epidemiology ofhepatocellular carcinoma： anemphasis on demographic andregional variability [J]. ClinLiver Dis， 2015，19（02）：223-238.

[2]Cronin KA， Ries LA， Edwards BK.The Surveillance， Epidemiology，and End Results （SEER） Program ofthe National Cancer Institute[J].Cancer， 2014，120 Suppl 23： 3755-3757.

[3]Kolde R， Laur S， Adler P， ViloJ. Robust rank aggregation forgene list integration and Metaanalysis [Jl. Bioinformatics，2012，28 （04）： 573-580.

[4]Vosa U， Kolde R， Vilo J， et al.Comprehensive Meta-analysis ofmicroRNA expression using a robustrank aggregation approach [J].Methods Mol Biol， 2014， 1182： 361-373.

[5]白文萱，高健，錢程等，肝癌相關差異表達基因的生物信息學分析[J].中華肝臟病雜志，2017， 25 （06）： 435-437.

[6]高冰，寧淑芳，唐艷萍等，人肝癌組織及癌旁正常肝組織的mRNA差異表達譜[J].世界華人消化雜志，2014 （31）： 4734-4744.

[7] Mou T， Zhu D， Wei X， et al.Identification and interactionanalysis of key genes and microRNAsin hepatocellular carcinoma bybioinformatics analysis [Jl. WorldJ Surg Oncol， 2017，15 （01）：63.

[8] Zhang C， Peng L， Zhang Y，etal. The identification ofkey genes and pathways inhepatocellular carcinoma bybioinformatics analysis ofhigh-throughput data [Jl. MedOncol， 2017， 34 （06）： 101.

[9]Shi SQ， Ke JJ， Xu QS， et al.Integrated network analysisto identify the key genes，transcription factors，and microRNAs involved inhepatocellular carcinoma [J] .Neoplasma， 2018， 65 （01） ： 66-74.

[lO]El-Wahab NM， Rashed HG， El-Sherif WT， et al. Glypican-3 andMelanoma Antigen Genes l and 3 asTumor Markers for HepatocellularCarcinoma [Jl. Egypt J Immunol，2017，24（02）：187-200.

[ll]Liu H， Yang C， Lu W， et al.Prognostic significance ofglypican-3 expression inhepatocellular carcinoma： A Meta-analysis[Jl. Medicine （Baltimore），2018， 97 （04）： e9702.

[12]Tahon AM， El-Ghanam MZ， Zaky S，etal. Significance of Glypican-3 inEarly Detection of HepatocellularCarcinoma in CirrhoticPatients [J]. J GastrointestCancer， 2018， [Epub ahead ofprint].

[13]2hang J， Zhang M， Ma H， et al.Overexpression of glypican-3 isa predictor of poor prognosisin hepatocellular carcinoma： Anupdated Meta-analysis [J] . Medicine（Bal t imore） ， 2 018， 97 （24） ： elll 3 0.

[14]Lin SY， Pan HW， Liu SH， etal. ASPM is a novel markerfor vascular invasion， earlyrecurrence， and poor prognosis ofhepatocellular carcinoma [J]. ClinCancer Res， 2008， 14 （15） ： 4814-4820.

[15]Shibata R， Mori T， Du W， etal. Overexpression of cyclase-associated protein 2 in multistagehepatocarcinogenesis [J] .

ClinCancer Res， 2006，12 （18）： 5363-5368.

[16]Lu M， Huang X， Chen Y， et al.Aberrant KIF20A expression mightindependently predict pooroverall survival and recurrence-free survival of hepatocellularcarcinoma [J] . IUBMB Life，2018， 70 （04）： 328-335.

[17]Kijima H， Sawada T， TomosugiN，et al. Expression of hepcidinmRNA is uniformly suppressed inhepatocellular carcinoma [J]. BMCCancer， 2008， 8： 167.

[18]Critelli R， Milosa F， FaillaciF， et al. Microenvironmentinflammatory infiltrate drivesgrowth speed and outcome ofhepatocellular carcinoma： aprospective clinical study [Jl.Cell Death Dis， 2017， 8 （08） ： e3017.

[19] Hu K， Wang ZM， Li JN， et al.CLECIB Expression and PD-Ll Expression Predict ClinicalOutcome in HepatocellularCarcinomawithTumorHemorrhage [J] .

Transl Oncol，2018，11（02）： 552-558.

[20]Ho DW， Kai AK， Ng IO. TCGA whole-transcriptome sequencing datareveals significantly dysregulatedgenes and signaling pathways inhepatocellular carcinoma [J]. FrontMed， 2015， 9 （03） ： 322-330.

[21]Luo JH， Ren B， Keryanov S， etal. Transcriptomic and genomicanalysis of human hepatocellularcarcinomas and hepatoblastomas [J].Hepatology， 2006， 44 （04）： 1012-1024.