姚冬兒,楊慧琳,斯興開,張賓,孫繼鵬
(1.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院,浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點實驗室,浙江舟山 316022)(2.國家海洋局第三海洋研究所,福建廈門 361005)
金屬硫蛋白(Metallothionein,MT)化學名為金屬硫組氨酸三甲基內(nèi)鹽,其是一類低分子質(zhì)量、高巰基含量、能結(jié)合金屬離子,且具有獨特功能的蛋白質(zhì)。MT富含半胱氨酸(20~30%)且不含組氨酸和芳香族氨基酸等,其廣泛存在于多種動物、植物、微生物體內(nèi),其在個體生長發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[1]。機體內(nèi)MT可被重金屬離子、細胞毒性藥物、有機化學藥物、細胞因子、荷爾蒙激素及應(yīng)激刺激等多因素誘導(dǎo)而合成。研究表明,MT可表現(xiàn)出顯著的重金屬的解毒和調(diào)節(jié)[2]、參與細胞調(diào)節(jié)與免疫代謝[3]、防輻射[4]、清除生物體內(nèi)自由基[5]等多種生物活性,已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、保健、生物工程和環(huán)境保護等各個領(lǐng)域。
近年來,MT的生物功能已被越來越多的學者們所認識和開發(fā),對其結(jié)構(gòu)、特性、基因調(diào)控及生物學功能的研究也日趨深入,但對其應(yīng)用與產(chǎn)品開發(fā)仍有諸多限制和不足[6]。純度較高的MT在市場上的價格仍舊居高不下,其主要原因在于未能找到一種合理高效的提純技術(shù),且動植物提純量少的缺點仍舊嚴重制約著MT的工業(yè)化發(fā)展[7]。目前,關(guān)于MT的提取及分離純化已有較多介紹,諸如加熱除雜蛋白、緩沖液勻漿離心法、凝膠過濾、離子交換及多種層析結(jié)合法等,然而其分離純化方法仍有待進一步提高,仍存在如雜蛋白干擾嚴重、MT提取率不高等問題[8,9]。本研究以褶牡蠣中金屬硫蛋白(MT)為對象,通過 Cd2+誘導(dǎo)褶牡蠣體內(nèi)產(chǎn)生MT,優(yōu)化牡蠣體內(nèi)MT提取條件,以期獲得MT制備的最佳工藝,為天然高效的海洋源MT產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用提供一定的參考。
褶牡蠣(Crassostrea plicatul)購自浙江省舟山市東河水產(chǎn)批發(fā)市場,殼長8.4~8.8 cm,殼高3.0~3.7 cm,體重 22~28 g。氯化鎘、三羥甲基氨基甲烷、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、硼酸及EDTA等試劑,均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。
XHF-D型內(nèi)切式勻漿機,寧波新芝生物科技股份有限公司;Milli-Q型超純水儀,美國Millipore公司;DLSB-20/20型低溫冷卻液循環(huán)泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RC6 Plus型高速冷凍離心機,Thermo Scientific公司;DSHZ-300型恒溫振蕩器,江蘇太倉市實驗設(shè)備廠等。
1.3.1 牡蠣體內(nèi)MT的誘導(dǎo)
選取生長活力良好的褶牡蠣個體,進行海水暫養(yǎng)馴化2 d,暫養(yǎng)期間不投喂餌料。將暫養(yǎng)牡蠣放入塑料養(yǎng)殖箱中,60只/箱,每只養(yǎng)殖箱注入含0.5 mg/L Cd2+的凈化海水 40 L(鹽度 27±1,pH 8.0±0.2,水溫18±1 ℃);保持連續(xù)充氧,但不投喂餌料;每隔24 h更換含相同Cd2+濃度海水1次。采用Cd2+誘導(dǎo)10 d后,取出牡蠣個體,在0~4 ℃條件下,將牡蠣進行解剖,獲得牡蠣肉置于-80 ℃條件下進行貯存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 牡蠣MT提取優(yōu)化
1.3.2.1 單因素實驗
(1)物料比對 MT提取效果影響:取牡蠣組織約 5 g,置于 50 mL錐形瓶中,按牡蠣組織:緩沖液(g/mL)比例分別為1:2、1:3、1:4、1:6、1:8和1:10,加入0.25 mol/L、pH 8.5 Tris-HCl緩沖液,45 ℃恒溫水浴振蕩提取2 h后,將混合體系以10000 r/min離心20 min(4 ℃),收集上清液測定MT含量。
(2)提取溫度對 MT提取效果影響:取牡蠣組織約5 g,置于50 mL錐形瓶中,按牡蠣組織:緩沖液(g/mL)比例為1:4,加入0.25 mol/L、pH 8.5 Tris-HCl緩沖液,分別于20、30、40、50、60和70 ℃條件下,45 ℃恒溫水浴振蕩提取2 h后,將混合體系以10000 r/min離心20 min(4 ℃),收集上清液測定MT含量。
(3)提取pH對MT提取效果影響:取牡蠣組織約 5 g,置于 50 mL錐形瓶中,按牡蠣組織:緩沖液(g/mL)比例為1:4,分別加入pH為3、4、5、6、7、8、9和10、0.25 mol/L Tris-HCl緩沖液,45 ℃恒溫水浴振蕩提取2 h后,將混合體系以10000 r/min離心20 min(4 ℃),收集上清液測定MT含量。
(4)提取液濃度對 MT提取效果影響:取牡蠣組織約5 g,置于50 mL錐形瓶中,按牡蠣組織:緩沖液(g/mL)比例為1:4,加入pH 8.5、濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.20、0.30和0.50 mol/L Tris-HCl緩沖液,45 ℃恒溫水浴振蕩提取2 h后,將混合體系以10000 r/min離心20 min(4 ℃),收集上清液測定MT含量。
(5)提取時間對 MT提取效果影響:取牡蠣組織約5 g,置于50 mL錐形瓶中,按牡蠣組織:緩沖液(g/mL)比例為1:4,加入0.25 mol/L、pH 8.5 Tris-HCl緩沖液,45 ℃恒溫水浴振蕩提取,提取時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 h后,將混合體系以10000 r/min離心20 min(4 ℃),收集上清液測定MT含量。
1.3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計
在以上單因素實驗基礎(chǔ)上,采用Design-Expert 7.0軟件中Box-Behnken中心組合設(shè)計原理進行響應(yīng)面實驗設(shè)計,具體選取物料比、提取溫度、緩沖液pH及濃度四個因素,進行提取工藝優(yōu)化研究。
1.3.3 牡蠣MT含量測定
取 20 μL MT 上清液,加入 3 μL 20 %(m/V)TCEP溶液、10 μL 1 mg/mL SBD-F 溶液和 75 μL、pH 10.5反應(yīng)緩沖液(含1 mol/L硼酸、30 mmol/L EDTA和0.8 mol/L KOH),混勻后50 ℃水浴反應(yīng)30 min,加入10 μL、4 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。將混合體系采用20 mmol/L、pH 7.5定容緩沖液定容至1 mL,混合均勻溶液經(jīng)0.22 μm水系膜后進行HPLC分析。色譜流動相:乙腈:磷酸緩沖液(25 mmol/L,pH 7.5):甲醇體系=18:80:2;色譜柱:ODS-BP(Sinochrom,4.6 mm×250 mm,5 μm)C18柱;進樣量:40 μL;洗脫時間:20 min;流速:0.5 mL/min;柱溫:25 ℃;激發(fā)波長380 nm,發(fā)射波長510 nm;標準品:兔肝MT;MT保留時間:7.3~7.7 min。
1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
采用origin 8.0、SPSS及Design Expert 8.0進行處理,實驗數(shù)據(jù)均為3次平行實驗的平均值,結(jié)果表示為平均值±標準差。
2.1.1 物料比對牡蠣MT提取效果的影響
圖1 物料比對牡蠣MT提取效果的影響Fig.1 Effects of material ratio on the extraction of MT from oyster
提取液采用緩沖液的主要作用是為促進可溶蛋白溶出及為其提供相對穩(wěn)定的環(huán)境,防止其變性發(fā)生。研究表明,水產(chǎn)動物體內(nèi)MT分子量較小,采用與生理體液相容性較好、性質(zhì)溫度的Tris-HCl緩沖液進行浸提,可有效將MT從牡蠣組織提取出來[10]。由圖1結(jié)果可知,牡蠣組織與提取緩沖液的物料比在1:2~1:6范圍內(nèi),提取MT含量隨緩沖液加入體積的增加而逐漸上升;當物料比為1:6時,MT提取含量達到最大值為0.184 mg/g;繼續(xù)增加提取液的加入量,MT提取量趨于平緩,未出現(xiàn)顯著提高(p>0.05)。隨著緩沖液用量增大,其與已破碎的組織接觸更加充分,從而使得更多的MT釋放到液相中。但是,過多緩沖液的稀釋作用必然會降低提取液中的濃度,不便于測定和使用,同時還會造成提取成本的增加。因此,初步確定牡蠣組織與提取緩沖液的物料比為1:4~1:6。
2.1.2 提取溫度對牡蠣MT提取效果的影響
圖2 提取溫度對牡蠣MT提取效果的影響Fig.2 Effects of temperature on the extraction of MT from oyster
提取溫度是影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定的最重要因素,一般溫度越高,蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性越低。MT由于其特殊的堅固構(gòu)象,而具有較強的熱穩(wěn)定性,因此短時間的熱提取處理不會影響牡蠣MT的生物活性[11]。由圖2可知,提取溫度在20~70 ℃范圍內(nèi),MT提取量呈先上升后下降的趨勢。當提取溫度較低時(20~30 ℃),MT提取效果較佳,30 ℃時MT提取量達最大值0.185 mg/g;當超過30 ℃后,MT提取量有所降低,可能是因為較高溫使部分組織蛋白變性而影響MT提取量所致。勵建榮等[12]也認為,采用較高溫度(75 ℃)除雜蛋白的方法制得MT粗制品,也存在一定弊端,其加熱時間不太明確,對提取MT純度及后續(xù)純化帶來不便。因此,初步確定提取溫度為30 ℃。
2.1.3 提取液pH對牡蠣MT提取效果的影響
圖3 提取液pH對牡蠣MT提取效果的影響Fig.3 Effects of pH on the extraction of MT from oyster
由圖3結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著提取液pH值的變化,MT提取量呈先增加后平緩再降低的趨勢;當pH在3~9之間,MT提取量隨pH提高而逐漸增加;當pH=9時,MT含量達到最高為0.174 mg/g;而當pH>9時,MT提取量逐漸下降,故初步確定最佳提取液pH值為9。MT等電點在3.5~6.0范圍內(nèi)[13],因此當提取緩沖液pH在3~6時,MT溶解減少而發(fā)生聚集,因此所獲得的MT提取量較低;提取緩沖液pH在8~9時,偏離MT的等電點,致使獲得MT提取量顯著提高。
2.1.4 提取緩沖液濃度對牡蠣MT提取效果的影響
圖4 提取緩沖液濃度對牡蠣MT提取效果的影響Fig.4 Effects of buffer concentrations on the extraction of MT from oyster
提取緩沖液的離子強度,對MT提取量也具有重要影響。隨著提取液濃度的增高,溶液的離子強度隨之增大,而較高的離子強度可能會造成提取蛋白質(zhì)的沉淀發(fā)生[14]。由圖4結(jié)果可知,在提取緩沖液濃度為0.01~0.30 mol/L范圍內(nèi),MT提取量逐漸上升,在0.30 mol/L時達最大值0.146 mg/g;在0.30~0.50 mol/L范圍內(nèi),MT提取率呈平緩稍下降趨勢,因此初步確定最佳緩沖液濃度為0.30 mol/L。
2.1.5 提取時間對MT提取效果的影響
圖5 提取時間對牡蠣MT提取效果的影響Fig.5 Effects of time on the extraction of MT from oyster
如圖5所示,提取時間對MT提取含量的影響相對較小,在0.5~6.0 h提取時間范圍內(nèi),MT提取量變化呈平緩趨勢;在提取2.0 h時MT含量達到穩(wěn)定值0.214 mg/g,確定最佳提取時間為2 h。
2.2.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果
根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取對MT提取量具有顯著影響的4因素,即提取緩沖液pH、提取時間、物料比和提取緩沖液濃度,進行4因素3水平Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計,以MT提取量為相應(yīng)值,進行29組實驗,包括24組析因?qū)嶒灱?組中心實驗用以估計誤差,結(jié)果如表1所示。
表1 中心組合實驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Experimental design and results of center combination
?
2.2.2 MT提取量響應(yīng)面分析
利用Design Expert 7.0軟件,將表1中實驗數(shù)據(jù)進行多元方程回歸擬合,建立MT提取量與各因素變量的二次多元回歸模型:
Y=0.23-0.012A-4.667E-003B-4.667-003C-0.014D-0.01AB+4.75E-003AC+4.25-003AD+2.5E-004BC-7.5E-003BD+8E-003CD-0.035A2-0.021B2-0.022C2-0.011D2
由表2方差分析可知,模型F=10.54,p<0.0001,說明響應(yīng)面回歸模型極其顯著,具有統(tǒng)計學意義。對殘差項各數(shù)據(jù)進行分析,失擬項 F=5.39,Pr=0.0594>0.05,說明方程實際擬合中非正常誤差所占比例小,擬合度較高。決定系數(shù)R2=0.9133,說明該模型能解釋91.33%響應(yīng)值變化,因而模型擬合程度良好,實驗誤差小,適合于牡蠣MT提取量的分析和預(yù)測。
表2 提取含量二次多項模型方差分析表Table 2 The variance analysis table of quadratic polynomial model of extraction content
由回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗可知,因素A和因素D的P值均小于0.05,說明緩沖液pH值和物料比對牡蠣MT提取量影響極其顯著。平方項A2、B2、C2、D2也均小于0.05,說明A2、B2、C2和D2對MT提取量均有顯著影響。由表3結(jié)果可知,信噪比Adeq Precision值較高(11.0160),說明該模型可預(yù)測。通過比較回歸方程中一次項系數(shù)可知,影響MT提取量的影響因素主次為D>A>B=C,即物料比>提取pH值>提取溫度=緩沖液濃度。
表3 變異系數(shù)Table 3 Coefficient of variation
2.2.3 交互因子效應(yīng)分析
圖6 提取液pH和溫度對MT提取量的影響Fig.6 Effects of pH and temperature on the extraction of MT from oyster
按照所得二元二次回歸方程對兩兩因素進行運算,獲得交互因子響應(yīng)面及等高線圖,結(jié)果如圖6~11所示。處理條件的改變對響應(yīng)值的影響,可通過響應(yīng)曲面的坡度陡峭或者平緩體現(xiàn)出來。等高線形狀可反映出交互作用強弱,橢圓形表示兩因素交互作用較強,圓形則表示兩因素交互作用較弱;等高線排列越密集,說明因素變化對MT提取量影響越大。在同一橢圓形區(qū)域內(nèi),牡蠣MT提取量相同,在橢圓形中心點即為MT提取量的最高點,由中心向邊緣逐漸減少。由結(jié)果可知,所有曲面圖都呈良好的拋物線形狀,說明各因素的交互作用明顯,而各曲面圖均開口朝下,說明實驗結(jié)果Y(MT提取量)在實驗區(qū)域內(nèi)有最大值。
(1)提取液pH和溫度對MT提取量的影響
由圖6結(jié)果可知,隨著提取液pH值增加和提取溫度升高,MT提取量呈先上升后下降趨勢,表明適當增大提取pH值及溫度,可一定程度的提高MT提取量。在提取液pH值(A)與提取溫度(B)交互作用的等高線中,由于pH值等高線疏密程度比提取溫度等高線密度大,故提取液pH值對響應(yīng)值峰值的影響比提取溫度大。因此,當提取液pH為8.5~9.0、提取溫度為28~32 ℃時,可獲最佳MT提取效果。
(2)提取液pH和緩沖液濃度對MT提取量的影響
圖7 提取液pH和緩沖液濃度對MT提取量的影響Fig.7 Effects of pH and buffer concentration on the extraction of MT
由圖7可知,隨著提取液pH值和緩沖液濃度增加,MT提取量也均呈先上升后下降趨勢。從構(gòu)成等高線可看出,沿A軸移動過程中,其等高線比沿C軸的等高線密度更大,說明在pH值(A)和緩沖液濃度(C)的交互作用中,提取液pH值對MT提取效果影響較緩沖液濃度影響更大。因此,當pH為8.5~9.0、緩沖液濃度為0.25~0.30 mol/L時,可獲最佳MT提取效果。
(3)提取液pH和物料比對MT提取量的影響
圖8 提取液pH和物料比對MT提取量的影響Fig.8 Effects of pH and material ratio on the extraction of MT
圖9 提取液溫度和緩沖液濃度對MT提取量的影響Fig.9 Effects of temperature and buffer concentration on the extraction of MT
由圖8可知,隨著提取液pH值和物料比的增加,MT提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;而隨物料比的增加或減小,MT提取量變化程度相對平緩。在 pH值(A)與物料比(D)交互作用的等高線中,由于pH值對等高線疏密程度影響比物料比的影響更大些,因此提取液pH值的影響作用較物料比大。當pH為8.5~9.0、料物比為3.5~4.0時,能使MT提取效果最佳。
(4)提取溫度和緩沖液濃度對 MT提取量的影響
由圖9可知,隨著提取溫度和緩沖液濃度增加,MT提取量呈先增加后減小趨勢。在提取溫度(B)與緩沖液濃度(C)交互作用等高線中,沿B軸等高線與沿C軸等高線密度差別不大,可知提取溫度與緩沖液濃度對響應(yīng)值峰值的影響相當。當提取溫度為28~32 ℃、緩沖液濃度為0.25~0.30 mol/L時,可獲最佳MT提取效果。
(5)提取溫度和物料比對MT提取量的影響
圖10 提取溫度和物料比對MT提取量的影響Fig.10 Effects of temperature and material ratio on the extraction of MT
由圖10可知,隨提取溫度和物料比的升高,MT提取量呈現(xiàn)先增加后減小趨勢;與圖8結(jié)果類似,隨物料比增加或減小,MT提取量變化程度相對平緩。在提取溫度(B)和物料比(D)交互作用中,溫度對等高線疏密程度影響明顯大于物料比,說明提取溫度影響作用較物料比大。當提取溫度為28~32 ℃、料物比為3.5~4.0時,可獲最佳MT提取效果。
(6)緩沖液濃度和物料比對MT提取量的影響
圖11 緩沖液濃度和物料比對MT提取量的影響Fig.11 Effects of buffer concentration and material ratio on the extraction of MT
圖11曲面圖與等高線分布圖,和圖8結(jié)果大體相同,即提取緩沖液濃度的變化對響應(yīng)值的影響幅度明顯,即在提取緩沖液濃度(C)和物料比(D)交互作用中,緩沖液濃度的影響作用較物料比更大。當緩沖液濃度為0.25~0.30 mol/L、料物比為3.5~4時,可獲最佳MT提取效果。
2.2.4 最佳提取工藝驗證
利用Design-Expert 7.0軟件分析實驗數(shù)據(jù),確定最優(yōu)提取條件為:提取液pH 9.0,提取溫度30 ℃,提取緩沖液濃度0.25 mol/L,物料比為1:4;考慮到實際操作便利,確定提取時間為2 h。在此條件下,進行3次平行實驗,MT提取量平均值為0.221 mg/g,模型對MT提取量的理論最優(yōu)值為0.239 mg/g,兩者之間差值為0.018 mg/g,誤差較小,兩者吻合性較好,說明模型可行。
以牡蠣組織為原料,利用單因素實驗、中心組合Box-Behnken實驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法,對牡蠣中MT的提取制備工藝進行了優(yōu)化,獲得了最佳制備參數(shù)為:牡蠣組織與提取液間的比例為1:4,提取液pH 9.0,提取溫度30 ℃,緩沖液濃度0.25 mol/L,提取時間2 h。在此參數(shù)條件下,MT提取量為0.221 mg/g,該結(jié)果與建立模型的預(yù)測值基本相符。后續(xù)將對牡蠣MT進一步的純化及應(yīng)用開展深入研究。
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