史紅霞，劉永梅，黨曉群

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶401331)

自然界中90%的被子植物有性繁殖直接或間接依賴于傳粉昆蟲。據(jù)統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)傳粉昆蟲帶來的經(jīng)濟增益每年至少有2 250億美元，非蜜蜂屬膜翅目昆蟲傳粉的水果和蔬菜價值約30億美元［1］。然而近10 a間，由于環(huán)境污染、農(nóng)藥的大量使用以及蜂群崩潰失調(diào)癥(Colony collapse disorder，CCD)等，全球范圍內(nèi)蜜蜂種群數(shù)量正在不斷減少。北美地區(qū)在1947—2005年蜂群數(shù)量減少了59%，歐美地區(qū)1985—2005年則下降了25%［2-3］。4種之前在美國本土數(shù)量十分充足的大黃蜂數(shù)量下降了約96%［3］。2012—2013 年美國蜜蜂損失比例高達(dá)45%［4］，由此帶來的對農(nóng)業(yè)和生態(tài)系統(tǒng)的負(fù)面影響廣受農(nóng)業(yè)界及科學(xué)界的關(guān)注。

蜜蜂是集居的社會性昆蟲，蜂群成員間密切接觸使得它們更易受到各種傳染性疾病感染。到目前為止，在蜜蜂的不同級型、不同生長階段以及在其蜂巢、食物、寄生蟲等樣本中均能檢測到蜜蜂病毒［5］。現(xiàn)已分離鑒定的蜜蜂病毒超過22種。由于蜜蜂和其他傳粉昆蟲如大黃蜂、獨居蜂、胡蜂、蒼蠅、螞蟻、蝴蝶等所共有的采蜜行為，加速了它們之間病原體的傳播［6］。蜜蜂病毒的廣泛傳播可能是傳粉昆蟲數(shù)量下降的原因之一。重點概述了蜜蜂RNA病毒在傳粉昆蟲中的分布及致病性，并對蜜蜂病毒的跨物種傳播作一探討，為蜜蜂病害綜合防控體系的建設(shè)提供理論參考。

1 蜜蜂RNA病毒在傳粉昆蟲中的分布

1.1 蜜蜂卷翅病毒

蜜蜂卷翅病毒(Deformed wing virus，DWV)不僅是全球蜜蜂種群中最流行的病毒，也是寄主范圍最廣的蜜蜂病毒(表1)。DWV除通過瓦螨(Varroa destructor)傳播至東方蜜蜂(Apis cerana)外，也可以在非人工飼養(yǎng)的大蜜蜂(Apis dorsata)、小蜜蜂(Apis florea)、普通黃胡蜂(Vespula vulgaris)、小木匠蜂(Ceratina dupla)、紅壁蜂(Osmia bicornis)種群中廣泛傳播［7-9］(表 1)。Gamboa 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在哥倫比亞的熱帶熊蜂(Bombus atratus)中也存在DWV。北美數(shù)量最多的幾種熊蜂如東方熊蜂(Bombus impatiens)、亨特大黃蜂(Bombus huntii)和墨西哥熊蜂(Bombus vagans)中也檢測到了DWV，DWV對歐洲熊蜂(Bombus terrestris)的致死率高達(dá) 50%［11-13］。

DWV的寄主域不僅局限于昆蟲綱，越來越多的研究表明，DWV可以在瓦螨中復(fù)制增殖［14］。DWV可以誘導(dǎo)感染瓦螨的蜂蛹產(chǎn)生免疫抑制，促進(jìn)瓦螨繁殖。Di等［15］在研究瓦螨與病毒共生對蜜蜂免疫系統(tǒng)的影響時提出，DWV和狄斯瓦螨是互惠共生的關(guān)系，DWV對蜜蜂個體和群體的致病性取決于寄生螨類的多少。狄斯瓦螨不僅可以影響DWV在蜂群內(nèi)的多樣性，而且還影響DWV在蜂群中的感染力和致病力。

1.2 蜜蜂黑蜂王臺病毒

蜜蜂黑蜂王臺病毒(Black queen cell virus，BQCV)于1977年由Bailey等［16］首次從西蜂蜂王前蛹期的黑色細(xì)胞中分離出，是引起蜂王幼蟲死亡的主要原因。BQCV一度被認(rèn)為是西蜂中最為流行的病毒之一。近幾年來，在西雙版納野生小蜜蜂和大蜜蜂以及臺灣、日本的Apis cerana indica、Apis cerana japonica 蜂群中也相繼檢測到了 BQCV［17-18］，對BQCV的核衣殼蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，推測BQCV有可能是從西蜂傳播到大蜜蜂和小蜜蜂［18］。BQCV不僅可以在蜜蜂屬內(nèi)進(jìn)行種間傳播，還可以感染非膜翅目昆蟲、蜂箱小甲蟲(Aethina tumida)、歐洲球螋(Forficcula auricularia)、大蠟螟(Galleria mellonella)以及蜘蛛等［8，19-20］。Singh 等［6］采集了賓夕法尼亞州、紐約、伊利諾斯州等地區(qū)的蜜蜂以及一些非蜜蜂屬膜翅目昆蟲，并收集了它們攜帶的花粉，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)未患病蜜蜂和健康非蜜蜂屬膜翅目昆蟲及其攜帶的花粉中均可檢測到BQCV，推測BQCV可能通過傳粉昆蟲共同的訪花行為經(jīng)由花粉傳播至其他昆蟲。

1.3 AKI復(fù)合體

蜜蜂急性麻痹病毒(Acute bee paralysis virus，ABPV)、蜜蜂克什米爾病毒(Kashmir bee virus，KBV)以及以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus，IAPV)稱之為 AKI復(fù)合體［21］，三者可復(fù)合感染蜜蜂的弱勢群和健康群。該病主要在西蜂中暴發(fā)，在中蜂中比較少見。Bakonyi等［22］在西蜂瓦螨中檢測到 ABPV，但到目前為止，沒有關(guān)于ABPV在瓦螨中復(fù)制的報道。ABPV能感染熱帶熊蜂［10］，而且對巴西蜜蜂的感染率為 100%［23］。

IAPV和KBV、ABPV基因組相似性分別為75%和 65%［24］。Berényi等［25］猜測 IAPV 可能是 KBV的亞型。KBV和ABPV能感染相同的蜂群，甚至同一只蜜蜂。Cox-Foster等［26］采用宏基因組的方法，對正常巢脾和出現(xiàn)CCD癥狀的巢脾中微生物群落進(jìn)行RNA測序分析，發(fā)現(xiàn)KBV、IAPV與CCD關(guān)聯(lián)度最大。Singh等［6］對11種非蜜蜂屬膜翅目傳粉昆蟲的病毒進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，在歐洲熊蜂、普通黃胡蜂、墨西哥熊蜂、汗蜂(Augochlora pura)等中均能檢測到 IAPV(表 1)。

1.4 蜜蜂囊狀幼蟲病毒

蜜蜂囊狀幼蟲病是1913年首種被發(fā)現(xiàn)的蜜蜂病毒病，其病原體為蜜蜂囊狀幼蟲病毒(Sacbrood virus，SBV)［27］。SBV 可感染成蜂和幼蟲，患病幼蟲體色會由乳白色逐漸變黃，不能正?；?，最后變成囊狀，但對成蜂威脅不嚴(yán)重。目前，對于SBV已經(jīng)分離出幾種亞洲毒株如韓國株(Korea sacbrood virus，KSBV)［28］、中國株 (Chinese sacbrood virus，CSBV)［29］、泰國株(Thai sacbrood virus，TSBV)［30］。SBV與CSBV同源性很高，不交叉感染。但Gong等［31］發(fā)現(xiàn)，感染中華蜜蜂的SBV也可以感染西蜂，具有一定的致病性。瓦螨中雖能檢測到SBV的存在，但其不能復(fù)制，這說明瓦螨可能作為SBV的載體去感染其他生物［32］。關(guān)于SBV在非蜜蜂屬昆蟲中寄生的報道很少(表1)，僅在一些熊蜂和Andrena vaga中檢測到［9］，暗示SBV具有較窄的寄主域。

1.5 蜜蜂慢性麻痹病毒和緩慢性麻痹病毒

蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus，CBPV)是一種還未分類的病毒。該病毒為正義單鏈RNA病毒，基因組由5段組成。目前已完成測序的是由3 647個堿基組成的RNA1和由2 305個堿基組成的RNA2，其余為其衛(wèi)星病毒所有［33］。CBPV多在西蜂蜂群中流行，但在東方蜜蜂、歐洲熊蜂、東方熊蜂、螞蟻、瓦螨中均有分布，推測瓦螨可作為CBPV 的載體，加快CBPV侵染［34-35］。

蜜蜂緩慢性麻痹病毒(Slow bee paralysis virus，SBPV)屬于傳染性軟腐病毒科。Mcmahon等［17］對從英國和比利時收集到的幾種野生熊蜂屬昆蟲病毒進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，SBPV可感染熊蜂，但相對于蜜蜂中檢測到的SBPV，其在熊蜂中的感染水平更高，推測SBPV可能由其他傳粉昆蟲傳播至蜜蜂［36］。

表1 蜜蜂病毒在傳粉昆蟲中的分布

2 蜜蜂病毒病的診斷與防治

2.1 蜜蜂病毒病的診斷

對于蜜蜂病毒病形態(tài)學(xué)的檢測，一般都是基于蜜蜂的患病癥狀、流行病學(xué)初步作出判斷，然后進(jìn)行電鏡觀察，根據(jù)其病原特征，確定病毒類型(表2)。然而，對于致病癥狀類似的蜜蜂病毒，如以色列急性麻痹病毒、蜜蜂慢性麻痹病毒、緩慢性麻痹病毒均會誘發(fā)蜜蜂出現(xiàn)翅膀震顫、失去飛行能力、爬蜂等現(xiàn)象，并且病毒粒子多為直徑20～30 nm的正二十面體，外形也比較相似，僅僅依靠癥狀和電鏡觀察很難將病原體進(jìn)行區(qū)分，此時則可借助分子生物學(xué)診斷技術(shù)來鑒定。

目前，已有的蜜蜂病毒病檢測方法主要有瓊脂凝膠免疫擴散法、酶聯(lián)免疫法、電子顯微鏡法、蛋白質(zhì)印記法、寡核苷酸微列陣芯片技術(shù)、RT－PCR法、RT－qPCR法、多重連接依賴式探針擴增技術(shù)。酶聯(lián)免疫法可高通量檢測多種病毒。免疫膠體金試紙條檢測法使用方便快速，便于基層和現(xiàn)場使用，所有反應(yīng)能在15 min內(nèi)完成，成本低，應(yīng)用范圍廣。而分子檢測的極高靈敏度也使其成為目前進(jìn)行蜜蜂病毒學(xué)研究的主要工具。其中，寡核苷酸微列陣芯片和多重連接依賴式探針擴增技術(shù)可以同時檢測9～10種病毒。RT－PCR、RT－qPCR可以定量和定性地檢測病毒，目前應(yīng)用范圍最廣［37-39］。

表2 幾種常見蜜蜂病毒病的病原特征和癥狀

2.2 蜜蜂病毒病的防治

根據(jù)蜜蜂病毒病的病因、病源和傳播途徑，研究者進(jìn)行了廣泛的防治技術(shù)研究。概而言之，主要有物理防治和藥物防治2種。蜂農(nóng)常通過蜂場、蜂具及飼料的衛(wèi)生與消毒來預(yù)防。另外，還可通過選育抗病蜂種、選擇耐病性好的蜂種進(jìn)行預(yù)防。藥物防治包括抗生素的使用和中草藥飼喂，這些仍是蜂農(nóng)們賴以使用的有效方法，但藥物殘留對蜜蜂健康以及蜂產(chǎn)品質(zhì)量都有不同程度的影響。

RNAi(RNA interference)技術(shù)是目前實現(xiàn)疾病治療的有效方法之一。該技術(shù)具有特異性和高效性，可以特異地沉默或下調(diào)某個基因的表達(dá)水平，從分子水平上削弱或消除病毒的增殖。2016年，韓日疇課題組以中蜂SBV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因為靶標(biāo)基因，進(jìn)行dsRNA干擾試驗，發(fā)現(xiàn)蜜蜂幼蟲的死亡率明顯下降［40］，為中蜂囊狀幼蟲病毒病乃至所有蜜蜂病毒病的防治提供了新的思路。

3 展望

隨著全球化進(jìn)程加劇，傳粉昆蟲的商業(yè)化使得本土傳粉昆蟲被引入到其他國家，如原產(chǎn)于歐洲、非洲和中東的西方蜜蜂已被引入世界各地。20世紀(jì)80年代后期，大黃蜂、熊蜂等也相繼輸入到不同國家，對當(dāng)?shù)貍鞣劾ハx的健康造成嚴(yán)重威脅，也直接影響了當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)的平衡。蜜蜂RNA病毒在傳粉昆蟲中的廣泛分布可能是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)傳粉昆蟲數(shù)量急劇下降的原因之一。RNA病毒的跨物種傳播仍有很多問題亟待研究。第一，對于大部分傳粉昆蟲，是否存在蜜蜂RNA病毒還未展開研究，對傳粉昆蟲中病毒的全面調(diào)查分析將為病毒的跨物種傳播研究提供更多線索，以便評估傳粉昆蟲的潛在健康威脅。第二，蜜蜂是否通過采集帶病毒的花粉傳播病毒，花粉或蜂蜜中的病毒是否具有感染性，均不清楚。第三，自然界中病毒與花粉植物之間存在怎樣的互作關(guān)系，花粉在病毒的跨物種傳播中有何作用，需要闡明。第四，蜜蜂病毒的寄主域如何，也需要明確。研究表明，DWV、BQCV和AKI具有較寬的寄主域，而SBV、CBPV和SBPV的寄主范圍則相對較窄，提示DWV、BQCV和AKI的傳粉昆蟲應(yīng)避免商業(yè)性輸出。因此，應(yīng)加強傳粉昆蟲病毒學(xué)的深入研究，評估這些病毒對傳粉昆蟲健康的影響，揭示不同傳粉昆蟲在病毒傳播中扮演的角色，進(jìn)而抑制具有廣泛寄主域的病毒的流行與傳播，緩解現(xiàn)今傳粉昆蟲數(shù)量急劇下降的問題。傳粉昆蟲病毒學(xué)的研究對在自然生態(tài)系統(tǒng)中建立病原體的綜合防控監(jiān)測體系也具有重要意義。

［1］ Robinson W S，Nowogrodzki R，Morse R A.The value of honey bees as pollinators of U.S.crops［J］.American Bee Journal，1989，129(13):411-423.

［2］ Engelsdorp D V，Hayes J J，Underwood R M，et al.A survey of honey bee colony losses in the United States，fall 2008 to spring 2009［J］.Journal of Apicultural Research，2010，49(1):7-14.

［3］ National Research Council.Status of pollinators in North America［M］.Washington，D C:The National Academies Press，2007:34-103.

［4］ USDA.Beekeepers lost 44%of honey bee colonies last year［EB/OL］.(2016-05-10) ［2017-07-26］.https://www.ecowatch.com/usda-beekeepers-lost-44-of-honeybee-colonies-last-year-1891129451.html.

［5］ Chen Y P，Siede R.Honey bee viruses［J］.Advances in Virus Research，2007，70(1):33-80.

［6］ Singh R，Levitt A L，Rajotte E G，et al.RNA viruses in hymenopteran pollinators:Evidence of inter-taxa virus transmission via pollen and potential impact on non-Apis Hymenopteran species［J］.PLoS ONE，2010，5(12):e14357.

［7］ Reynaldi F J，Sguazza G H，Albicoro F J，et al.First molecular detection of co-infection of honey bee viruses in asymptomatic Bombus atratus in south America［J］.Brazilian Journal of biology，2013，73(4):797-800.

［8］ Levitt A L，Singh R，Coxfoster D L，et al.Cross-species transmission of honey bee viruses in associated arthropods［J］.Virus Research，2013，176(1/2):232-240.

［9］ Ravoet J，De S L，Meeus I，et al.Widespread occurrence of honey bee pathogens in solitary bees［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2014，122:55-58.

［10］ Gamboa V，Ravoet J，Brunain M，et al.Bee pathogens found in Bombus atratus from Colombia:A case study［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2015，129:36-39.

［11］ Genersch E，Yue C，F(xiàn)ries I，et al.Detection of deformed wing virus，a honey bee viral pathogen，in bumble bees(Bombus terrestris and Bombus pascuorum)with wing deformities［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2006，91(1):61-63.

［12］ Graystock P，Meeus I，Smagghe G，et al.The effects of single and mixed infections of Apicystis bombi and deformed wing virus in Bombus terrestris［J］.Parasitology，2016，143(3):358-365.

［13］ Li J，Peng W，Wu J，et al.Cross-species infection of deformed wing virus poses a new threat to pollinator conservation［J］.Journal of Economic Entomology，2011，104(3):732-739.

［14］ Gisder S，Genersch E.Viruses of commercialized insect pollinators［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2016，147:51-59.

［15］ Di P G，Annoscia D，Margiotta M，et al.A mutualistic symbiosis between a parasitic mite and a pathogenic virus undermines honey bee immunity and health［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2016，113(12):3203-3208.

［16］ Bailey L，Woods R D.Two more small RNA viruses from honey bees and further observations on sacbrood and acute bee paralysis viruses［J］.Journal of General Virology，1977，37(1):175-182.

［17］ Mcmahon D P，F(xiàn)ürst M A，Caspar J，et al.A sting in the spit: Widespread cross-infection ofmultiple RNA viruses across wild and managed bees［J］.Journal of Animal Ecology，2015，84(3):615-624.

［18］ Zhang X，He S Y，Evans J D，et al.New evidence that deformed wing virus and black queen cell virus are multihost pathogens［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2012，109(1):156-159.

［19］ Donaldson E F，Haskew A N，Gates J E.Metagenomic analysis of the viromes of three North American bat species:Viral diversity among different bat species that share a common habitat［J］.Journal of Virology，2010，84(24):13004-13018.

［20］ Peng W，Li J，Boncristiani H，et al.Host range expansion of honey bee black queen cell virus in the bumble bee，Bombus huntii［J］.Apidologie，2011，42(5):650-658.

［21］ Forsgren E，Wei S，Ding G L，et al.Preliminary observations on possible pathogen spill-over from Apis mellifera to Apis cerana［J］.Apidologie，2014，46(3):1-11.

［22］ Bakonyi T，F(xiàn)arkas R，Szendroi A，et al.Detection of acute bee paralysis virus by RT-PCR in honey bee and Varroa destructor field samples: Rapid screening of representative Hungarian apiaries［J］.Apidologie，2002，33(1):63-74.

［23］ Ueira-Vieira C，Almeida L O，Almeida F C D，et al.Scientific note on the first molecular detection of the acute bee paralysis virus in Brazilian stingless bees［J］.Apidologie，2015，46(5):628-630.

［24］ 張炫，周丹銀，和紹禹.蜜蜂病毒病的檢測與診斷［J］.中國蜂業(yè)，2012，63(Z4):56-63.

［25］ Berényi O，Bakonyi T，Derakhshifar I，et al.Occurrence of six honeybee viruses in diseased austrian apiaries［J］.Applied ＆ EnvironmentalMicrobiology，2006，72:2414-2420.

［26］ Cox-Foster D L，Conlan S，Holmes E C，et al.A metagenomic survey of microbes in honey bee colony collapse disorder［J］.Science，2007，318(5848):283-287.

［27］ White G F.Sacbrood，a disease of bees［M］.New York，USA:Bureau of Entomology，1913:1-5.

［28］ Reddy K E，Yoo M S，Kim Y H，et al.Analysis of the RdRp，intergenic and structural polyprotein regions，and the complete genome sequence of Kashmir bee virus from infected honeybees(Apis mellifera)in Korea［J］.Virus Genes，2014，49(1):137-144.

［29］ Zhang Y，Huang X，Xu Z F，et al.Differential gene transcription in honeybee(Apis cerana)larvae challenged by Chinese sacbrood virus(CSBV)［J］.Sociobiology，2013，60(4):413-420.

［30］ Rana R，Rana B S，Kaushal N，et al.Identification of sacbrood virus disease in honeybee，Apis mellifera by using ELISA and RT-PCR techniques［J］.Indian Journal of Biotechnology，2011，10(3):274-284.

［31］ Gong H R，Chen X X，Chen Y P，et al.Evidence of Apis cerana sacbrood virus infection in Apis mellifera［J］.Applied ＆ Environmental Microbiology，2016，82(8):2256-2262.

［32］ Mondet F，Miranda J R D，Kretzschmar A，et al.On the front line:Quantitative virus dynamics in honeybee(Apis mellifera)colonies along a new expansion front of the parasite Varroa destructor［J］.PLoS Pathogens，2014，10(8):e1004323.

［33］ 鐘義，邵海英，傅麗君，等.慢性蜜蜂麻痹病毒半套式PCR檢測方法的建立［J］.病毒學(xué)報，2016，4(32):490-494.

［34］ Celle O，Blanchard P，Olivier V，et al.Detection of chronic bee paralysis virus(CBPV)genome and its replicative RNA form in various hosts and possible ways of spread［J］.Virus Research，2008，133(2):280-284.

［35］ 汪天澍，施騰飛，劉芳，等.安徽省七種蜜蜂病毒的發(fā)生與流行研究［J］.應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2015，52(2):324-332.

［36］ Parmentier L，Smagghe G，de Graaf D C，et al.Varroa destructor macula-like virus，lake sinai virus and other new RNA viruses in wild bumblebee hosts(Bombus pascuorum，Bombus lapidarius and Bombus pratorum) ［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2016，134:6-11.

［37］ Glover R H，Adams I P，Budge G，et al.Detection of honey bee (Apis mellifera) viruses with an oligonucleotide microarray［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2011，107(3):216-219.

［38］ De Smet L，Ravoet J，De Miranda J R，et al.BeeDoctor，a versatile MLPA-based diagnostic tool for screening bee viruses［J］.PLoS ONE，2012，7(10):e47953.

［39］ 劉學(xué)錄，童金鳳，馬振剛.蜜蜂主要病害及其病原PCR檢測研究進(jìn)展［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，47(1):147-152.

［40］ Zhang J Q，Zhang Y，Han R.The high-throughput production of dsRNA against sacbrood virus for use in the honey bee Apis cerana(Hymenoptera:Apidae) ［J］.Virus Genes，2016，52(5):1-8.