董硯博

（撫順市農(nóng)業(yè)特產(chǎn)學(xué)校，遼寧 撫順 113123）

大豆肽在人體內(nèi)吸收快、利用率高，能有效修補(bǔ)殘缺細(xì)胞，可促進(jìn)脂肪代謝和無(wú)機(jī)離子吸收，具有降血糖、降膽固醇、抗氧化、抗癌等功效。目前，國(guó)內(nèi)大豆蛋白的生產(chǎn)多以脫脂豆粕為原料，利用堿提工藝進(jìn)行提取，蛋白浸出率較高，但會(huì)有部分蛋白會(huì)損失，影響資源利用率。酶法水解蛋白條件溫和，安全可靠，產(chǎn)品色淺，且選擇性較高。為提高大豆肽產(chǎn)率，采用酶法水解脫脂豆粕制備大豆肽，通過(guò)選擇蛋白浸出溫度及酶種類(lèi)，利用正交試驗(yàn)確定最佳工藝條件及生產(chǎn)工藝流程，為提高優(yōu)質(zhì)大豆蛋白資源的利用率提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕：華農(nóng)集團(tuán)；Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味蛋白酶：丹麥諾維信公司；As1.398中性蛋白酶：無(wú)錫酶制劑廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；pHS-3C型精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠(chǎng)；電子分析天平：上海分析儀器公司。

1.3 大豆肽提取方法

取蛋白質(zhì)濃度3.5%的豆粕，完全溶于水中，在一定溫度下浸泡30 min，然后在100℃、20 min的條件下使蛋白變性，自然冷卻到50℃，加適量的酶（酶與底物的濃度比為600 U／g）酶解2 h，用檸檬酸調(diào)pH為4.3，滅酶后離心分離15 min，取上清液。

1.4 蛋白浸出溫度確定

高溫有利于蛋白浸出，但易導(dǎo)致蛋白變性；低溫不易導(dǎo)致蛋白變性，但不利于蛋白浸出。選擇50℃和80℃的條件浸蛋白。

1.5 單酶和雙酶酶解效果比較

不同的酶對(duì)豆粕的水解程度不同，對(duì)肽產(chǎn)率有直接影響。為使蛋白水解更徹底，分別用中性蛋白酶（600 U／g）、風(fēng)味蛋白酶（600 U／g）和雙酶體系（300 U／g的中性蛋白酶+300 U／g風(fēng)味蛋白酶）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為考察豆粕酶解的工藝條件，以肽產(chǎn)率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察中性與風(fēng)味蛋白酶的比例、水解溫度、pH 值、水解時(shí)間（分別以 A、B、C、D 表示）對(duì)大豆肽產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design

1.7 肽產(chǎn)率測(cè)定方法

用TCA可溶氮變化來(lái)衡量肽產(chǎn)率的高低：

式中：N2為反應(yīng)后酶解液TCA可溶氮含量；N1為反應(yīng)前豆粕浸出液TCA可溶氮含量；N0為凱氏定氮法測(cè)得的總氮含量。

豆粕浸出液TCA可溶氮含量測(cè)定方法：豆粕加適量水，控制蛋白質(zhì)含量為3.5%，混勻，取上清液1 mL，加 1 mL 20%的 TCA 振蕩 5 min，離心（4 000 r／min，10 min），上清液中的可溶性氮用福林酚法測(cè)得。取上清液0.5 mL，加4 mL福林酚試劑甲液反應(yīng)10 min，加入0.5 mL福林酚試劑乙液，混合振蕩后在30℃水浴顯色30 min，測(cè)定OD500，同時(shí)做空白試驗(yàn)，平行測(cè)定2次。反應(yīng)后，用酶解液1mL代替豆粕，按上述方法測(cè)定OD500。

表2 雙酶的加酶量Table 2 Enzyme dose of two enzymes

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白浸出溫度及水解酶對(duì)肽產(chǎn)率的影響

浸提溫度及水解酶對(duì)大豆肽產(chǎn)率的影響見(jiàn)表3。

表3 浸提溫度及水解酶對(duì)大豆肽產(chǎn)率的影響Table 3 Effect of leaching temperature and hydrolase on productivity of soybean peptide

由表3可見(jiàn)：50℃下浸蛋白的肽產(chǎn)率明顯高于在80℃，雙酶水解蛋白的肽產(chǎn)率高于單一酶。綜合考慮，在50℃下采用雙酶法水解蛋白為宜。

2.2 酶最佳水解條件的確定

正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 4 Orthogonal test results and range analysis

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis results

由表4可以看出：試驗(yàn)8的肽產(chǎn)率較高，即中性酶與風(fēng)味酶的比例為 2∶1、溫度 55℃、pH 值 6.5、水解3 h，豆粕水解的肽產(chǎn)率最高，為31.52%。

比較4個(gè)因素的極差值可以看出，對(duì)肽產(chǎn)率的影響大小為：A＞D＞B＞C，即中性酶與風(fēng)味酶的比例影響最大，時(shí)間和溫度次之，pH值最小。

由方差分析可以看出：FA＞FD＞FB＞FC；FA，F(xiàn)D＞F0.01（2，9），說(shuō)明中性酶與風(fēng)味酶比例、水解時(shí)間對(duì)肽產(chǎn)率影響特別顯著；FB，F(xiàn)C＜F0.05（2，9）說(shuō)明溫度和 pH 對(duì)肽產(chǎn)率的影響不顯著。因此，酶解時(shí)可忽略溫度和pH值對(duì)豆粕水解的影響。

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，在50℃下浸蛋白，采用雙酶法水解蛋白，可有效提高大豆肽產(chǎn)率。結(jié)合正交試驗(yàn)確定的最佳酶解條件為：在50℃條件下浸蛋白，中性酶∶風(fēng)味酶為 400∶200 U／g（Pr），酶解時(shí)間 3 h。