蔡 菲，安美忱，劉安妮

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

沙棘（Hippophae rhamnoides L.），俗稱醋柳、黑刺、酸刺，胡頹子科沙棘屬的灌木或小喬木[1]。其成熟果實(shí)為橙黃色的小漿果，近球形，味酸甜，清香且營養(yǎng)豐富[2]。沙棘果實(shí)富含多糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、脂肪酸、玉米黃素、蕃茄紅素、黃酮和酚類等營養(yǎng)成分，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功效[3]。

多糖，也稱為多聚糖，大多數(shù)多糖具有增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞和體外免疫功能，誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，具有抗感染、抗輻射、抗腫瘤、降血脂、抗氧化、抗凝血等活性，既可以作為藥物臨床治療，也可作為功能食品[4]。

研究表明，沙棘果實(shí)中的多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、增強(qiáng)免疫力等生物活性[5-6]，同時對于肝炎、心血管系統(tǒng)疾病、動脈粥樣硬化、過敏、促進(jìn)新陳代謝等[7]也起到了治療作用。

超聲波輔助提取法是天然產(chǎn)物活性成分提取的一種經(jīng)典方法，目前廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物有效成分的提取過程中。超聲波輔助提取法節(jié)省試劑，并且提取率高[8]。

試驗(yàn)采用超聲波法提取沙棘果實(shí)多糖，探討最佳提取工藝條件，并用纖維素DEAE和Sepharose CL-6B柱層析進(jìn)行分離純化，并對沙棘多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步測定。為今后開發(fā)利用沙棘資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘HS-12，黑龍江省農(nóng)科院漿果研究所提供；木瓜蛋白酶，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司提供；纖維素-DEAE，Whatman公司提供；Sepharose CL-6B，Pharmacia公司提供；葡聚糖T-10，T-40，T-70，T-110和T-2000，上海西格瑪奧瑞奇公司提供。

1.2 主要儀器

JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；755PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；FTS 135型傅立葉變換紅外光譜儀，美國BID-BAD公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀，日本島津公司LC-10A產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲波輔助提取沙棘多糖工藝的研究

（1）沙棘多糖的制備。取5.0 g沙棘果果漿，按一定的料液比加入去離子水，在一定的時間和超聲功率下進(jìn)行超聲波輔助提取多糖。提取液抽濾、濃縮（50℃，真空度＜0.09 MPa），80%乙醇溶液醇沉，靜置過夜（4℃），用微孔濾膜（0.45 μm） 抽濾得沉淀固體，凍干，得到沙棘果粗多糖。利用蒽酮-硫酸法[9]測定提取液中的多糖得率。

（2）超聲波輔助提取沙棘多糖工藝的單因素試驗(yàn)。以沙棘果果漿為原料（5.0 g），分別研究提取時間、料液比和超聲功率對多糖得率的影響，每次試驗(yàn)平行3次。

超聲波提取法的單因素試驗(yàn)見表1。

表1 超聲波提取法的單因素試驗(yàn)

（3）超聲波法提取沙棘多糖工藝優(yōu)化試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考查超聲功率、超聲時間和料液比這3個因素的相互影響，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以沙棘多糖的提取量為指標(biāo)，確定沙棘多糖的最佳提取工藝。

超聲波提取法的正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 超聲波提取法的正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.2 沙棘多糖分離純化的研究

（1） 脫蛋白方法比較。分別稱取1 g沙棘粗多糖，采用Sevag法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶同Sevag法聯(lián)用這3種方法來進(jìn)行脫蛋白處理，比較這3種方法的脫蛋白效果。

（2） DEAE-纖維素分離純化沙棘多糖的研究。將脫蛋白后的沙棘多糖配制成10 mg/mL溶液，利用陰離子交換劑DEAE-纖維素（2.0 cm×30 cm）柱層析進(jìn)一步分離純化，上樣量為5.00 mL，0～1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑流速1 mL/min。蒽酮-硫酸法跟蹤檢測至無糖檢出，收集多糖洗脫液，得到2個組分，富集主要多糖組分，再進(jìn)一步純化。

（3） Sepharose CL-4B凝膠柱層析。將富集主要多糖組分配制成10 mg/mL溶液，利用瓊脂糖凝膠Sepharose CL-4B柱（1.8 cm×40 cm） 分離純化，上樣量為5.00 mL，0.2 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1 mL/min，每1.00 mL為一管，收集洗脫液，蒽酮-硫酸法跟蹤檢測至無糖檢出。根據(jù)洗脫曲線收集多糖組分，經(jīng)濃縮、凍干，得到均一組分沙棘多糖（HRP），采用蒽酮-硫酸法測定純度。

1.3.3 沙棘多糖（HRP） 分子量測定

（1）液相色譜條件。LC-10A型高效液相色譜儀，檢測器，RID-10A型示差折光檢測器，數(shù)據(jù)處理工作站：Shimadzu CLASS-Vp工作站；色譜柱：Waters Ultrahydrogel 2000，7.8×300 mm；洗脫劑：超純水；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.7 mL/min；壓力：1.6 MPa。

（2） HRP分子量測定。準(zhǔn)確稱取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品T-10，T-40，T-70，T-110，T-2000 各 2.0 mg，使用去離子水，配制質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取10 μL進(jìn)樣，分別獲得每種葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時間。通過葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對數(shù)值與色譜峰保留時間來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

取2.0 mg沙棘多糖HRL通過以上方法進(jìn)行操作，可以得到色譜峰的保留時間，采用回歸方程，計(jì)算HRL的分子量。

1.3.4 沙棘多糖的紅外光譜分析

通過KBr壓片法，采用FIR-8400s傅立葉變換紅外光譜儀，對HRP的主要官能團(tuán)進(jìn)行分析，紅外光譜掃描范圍4 000～500 cm-1。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD） 表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

超聲功率對沙棘多糖提取量的影響見圖1，超聲時間對沙棘多糖提取量的影響見圖2，料液比對沙棘多糖提取量的影響見圖3。

圖1 超聲功率對沙棘多糖提取量的影響

圖2 超聲時間對沙棘多糖提取量的影響

圖3 料液比對沙棘多糖提取量的影響

由圖1可知，超聲功率對沙棘多糖的提取量影響顯著。當(dāng)料液比1∶20，超聲時間45 min，超聲功率在120～480 W時，沙棘多糖的提取量會逐漸增高。當(dāng)超聲功率為480 W時，多糖提取量最大是12.46±0.61 mg/g。當(dāng)超聲功率在480～600 W時，多糖的提取量隨功率的增大而下降?？赡苁且?yàn)殡S著超聲波功率的增大，植物細(xì)胞的破碎作用增強(qiáng)，加速了有效成分的溶解，因此提高了提取量；但當(dāng)超聲波的功率超過480 W時，溶解的雜質(zhì)增多，有效成分減少，使得提取量降低。因此，確定最佳超聲功率為480 W。

由圖2可知，當(dāng)料液比1∶20，超聲功率480 W，超聲時間15～30 min時，沙棘多糖的提取量隨著超聲時間的增加上升緩慢。當(dāng)提取時間為30～60 min時，超聲時間對沙棘多糖提取量的影響隨著時間的增加而增大。提取時間大于60 min時，增加逐漸緩慢。也許是隨著時間的增加，膜破碎程度漸漸增強(qiáng)，溶出物較多，得率較高。但當(dāng)繼續(xù)破碎時，雜質(zhì)相應(yīng)增加，有效成分溶解量減少，得率沒有顯著提高。為節(jié)省提取時間，因此選擇超聲時間為45 min，此時沙棘多糖的提取量為6.11±0.24 mg/g。

由圖3可知，當(dāng)超聲時間為45 min時，功率為480 W時，料液比在1∶10～1∶30，沙棘多糖提取量隨著料液比的升高先增加再減少。料液比在1∶10～1∶20，多糖提取量隨著料液比的增加而升高。當(dāng)料液比為1∶20時，多糖提取量達(dá)到最大，為15.65±0.70 mg/g。這可能是由于溶劑少時體系黏稠不利于多糖的提取，當(dāng)溶劑達(dá)到合適值時，多糖溶出最多，得率最高。當(dāng)料液比在1∶20～1∶30時，沙棘多糖提取量隨著料液比的增加而降低。因此選取料液比為1∶20作為提取最佳料液比。當(dāng)料液比為1∶20時，沙棘多糖的提取量達(dá)到最大值15.65±0.70 mg/g。然后提取量呈下降趨勢，所以選擇料液比為1∶20。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過對超聲功率、超聲時間、料液比的單因素試驗(yàn)，選擇出最佳條件分別為超聲功率480 W，超聲時間30 min，料液比1∶20。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)。

超聲波法提取沙棘多糖正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 超聲波法提取沙棘多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，3個因素影響總糖提取率的大小分別為A＞C＞B，主要影響參數(shù)為A2B3C2。即最佳提取參數(shù)為超聲功率480 W，超聲時間55 min，料液比1∶20。因?yàn)樽罴烟崛」に嘇2B3C2不包括在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表內(nèi)，考慮驗(yàn)證結(jié)論的準(zhǔn)確性，而進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。其結(jié)果為在最佳條件下，總糖提取量達(dá)到48.63 mg/g。確定了A2B3C2為最佳工藝，即超聲功率480 W，超聲時間55 min，料液比1∶20。

2.3 沙棘多糖分離純化

2.3.1 不同脫蛋白方法結(jié)果比較

脫蛋白方法比較見表4。

表4 脫蛋白方法比較

由表4可知，Sevag法脫蛋白，能夠去除蛋白質(zhì)51.10%，但是多糖損失率高；單獨(dú)使用木瓜蛋白酶法脫蛋白，雖然多糖損失率較低，但是脫蛋白效果差。利用木瓜蛋白酶與Sevag法，在保證多糖含量的同時，最大限度地去除了多糖中的蛋白質(zhì)，清除率為88.17%±0.43%，此法除蛋白工藝操作簡易、省時，是一種較為理想的除蛋白方法。

2.3.2 DEAE-纖維素和Sepharose CL-4B純化多糖

DEAE-纖維素純化多糖洗脫曲線見圖4，瓊脂糖凝膠CL-4B純化多糖洗脫曲線見圖5。

圖4 DEAE-纖維素純化多糖洗脫曲線

圖5 瓊脂糖凝膠CL-4B純化多糖洗脫曲線

脫蛋白的沙棘多糖采用DEAE-纖維素柱層分離純化多糖的洗脫曲線見圖4，可見得到2個組分。收集主要組分，采用瓊脂糖凝膠Sepharose CL-4B進(jìn)一步分離純化，得均一組分沙棘多糖（HRL），洗脫曲線見圖5。圖5顯示，洗脫峰是單一的吸收峰，峰形狹窄且對稱，并無拖尾現(xiàn)象，表明沙棘多糖（HRL）純度較高，蒽酮-硫酸法檢測其純度為90.53%±0.47%。

2.4 多糖分子量

利用高效液相色譜可以得到的標(biāo)準(zhǔn)品Dex tranT-10，DextranT-40，DextranT-70，DextranT-110，DextranT-2000保留時間TR及其相對分子量Mw。通過分子量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，以其相應(yīng)的色譜峰保留時間作為橫坐標(biāo)，獲得回歸方程lgMw=-0.484 2TR+11.18，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9。其中，Mw為葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的相對分子質(zhì)量，TR為色譜峰保留時間（min）。

試驗(yàn)計(jì)算所得，HRL-3保留時間為12.65 min，通過回歸方程，得到HRL-3的相對分子量Mw為1.32×105U。

2.5 紅外掃描

沙棘精多糖的紅外光譜見圖3。

圖3 沙棘精多糖的紅外光譜

在3 367.85 cm-1處有一個強(qiáng)寬峰為多糖中O-H的伸縮振動峰；在2 931.23處的小肩峰為C-H伸縮振動特征峰；1 743.56 cm-1處為酯化羰基（C=O） 的特征峰，說明多糖HRL-3中存在乙?；?。在1 603.87 cm-1處有特征峰，為羧基（COO-） 的特征峰，表明多糖HRL-3含有糖醛酸。1 417.98 cm-1處為C-H的伸縮振動峰；1 238.51 cm-1處為C-H的變角振動峰。1 016.71 cm-1處為羥基C-O-C鍵伸縮振動峰。913.24 cm-1處為吡喃環(huán)的伸縮振動峰；842.83 cm-1處顯示HRL-3含有α-糖苷鍵的特征吸收峰；在718.15處的小肩峰為C-H伸縮振動特征峰。

紅外光譜的分析結(jié)果顯示，HRL-3具有多糖的特征吸收峰，同時具有α-糖苷鍵和吡喃糖環(huán)。

3 結(jié)論

從沙棘（HS-12） 中提取出多糖，確定了超聲波法的適宜提取條件為超聲功率480 W，超聲時間55 min，料液比1∶20，沙棘多糖的提取量為48.63±0.59 mg/g。選取木瓜蛋白酶與Sevag法聯(lián)用可有效地去除沙棘多糖的蛋白，清除率達(dá)到88.17%±0.43%。通過DEAE-纖維素、SepharoseCL-4B凝膠柱純化后，得到均一組分沙棘多糖，

分子量為1.32×105U，純度90.53%±0.47%。紅光譜掃描顯示沙棘中可能具有多糖的特征吸收峰，并含有吡喃糖環(huán)和α-糖苷鍵。

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