李季，蔡錦芳，鄒林，李宗玉

(1鄭州市第一人民醫(yī)院，鄭州450004；2濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院)

骨肉瘤是兒童、青少年最常見(jiàn)的骨科惡性腫瘤，也是導(dǎo)致此年齡段患者病死的最主要原因之一。近年來(lái)，在外科手術(shù)及新輔助化療方面已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展，然而骨肉瘤患者的生存率并沒(méi)有提高[1]。骨肉瘤具有侵襲性強(qiáng)等惡性生物學(xué)特性，對(duì)化療藥物耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致骨肉瘤治療失敗的最主要原因[2]。近年來(lái)的研究證實(shí)，中藥及其提取物在逆轉(zhuǎn)耐藥方面具有很好的應(yīng)用前景[3]。流行病學(xué)研究證實(shí)，大蒜提取物具有預(yù)防、治療腫瘤的功效[4]，大蒜提取物中含有大量的含硫化合物，其中二稀丙基三硫化物即大蒜素(DATS)占50%～80%，其次是二烯丙基二硫化物和二烯丙基一硫化物[5]。DATS具有降血壓、抗感染、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤等功能[6]。有研究證實(shí)，非細(xì)胞毒性劑量的DATS能夠逆轉(zhuǎn)骨肉瘤U2-OS細(xì)胞中P-糖蛋白(P-gp)介導(dǎo)的多藥耐藥性[7]。2015年6月～2016年12月，本研究擬探討DATS對(duì)阿霉素(DOX)獲得性耐藥骨肉瘤細(xì)胞株的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 骨肉瘤Saos-2細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青霉素、鏈霉素、DOX及DATS購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，MTT溶液購(gòu)自上海哈靈生物科技有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自杭州邦易化工有限公司，RIPA蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，pERK1/2(sc-16981-R)、ERK1/2(sc-101761)、pAKT1(sc-293125)、AKT1(sc-7126)和內(nèi)參GAPDH(sc-47724)一抗均購(gòu)自美國(guó)Santa公司，羊抗兔、兔抗鼠二抗購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；酶標(biāo)儀(ELx800)購(gòu)自美國(guó)BioTek公司，凝膠成像儀(GelDoc2000)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建 采用間歇刺激法誘導(dǎo)骨肉瘤Saos-2細(xì)胞的耐藥細(xì)胞株，細(xì)胞生長(zhǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL)中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。高濃度DOX[經(jīng)查閱文獻(xiàn)[8]，并經(jīng)MTT試驗(yàn)驗(yàn)證：DOX對(duì)Saos-2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)值為(125.76±5.79)μg/L，故該濃度對(duì)于細(xì)胞屬高濃度]200 μg/L作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Saos-2細(xì)胞，4 h后撤藥，正常DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每周刺激1次，6個(gè)月內(nèi)共刺激了12次，建立的耐藥細(xì)胞株命名為Saos-2/DOX。

1.3 細(xì)胞生存率的檢測(cè) 采用MTT法。以0.8×104/孔的密度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，撤血清24 h，使細(xì)胞周期同步化，分別以含不同濃度的DOX或DATS完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，24、48、72 h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞生存率。具體方法為：每孔加10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，孵育4 h，棄掉上清，每孔加150 μL的DMSO，振蕩、溶解，于酶標(biāo)儀上測(cè)量490 nm波長(zhǎng)吸光度值。取每組6個(gè)復(fù)孔的吸光度值的均數(shù)，計(jì)算細(xì)胞生存率，即加藥組吸光度值與未加藥組吸光度值的比值。重復(fù)3次試驗(yàn)后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。IC50值，即細(xì)胞生存率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度，耐藥指數(shù)(RI)=耐藥細(xì)胞的IC50/親本細(xì)胞的IC50。

1.4 pERK1/2、ERK1/2、pAKT1和AKT1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集各組約1×107個(gè)細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。8% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h，TBS-T洗膜，分別加入pERK1/2、ERK1/2、pAKT1、AKT1和內(nèi)參GAPDH的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。TBS-T洗膜后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔或兔抗鼠二抗，室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像儀對(duì)蛋白條帶進(jìn)行觀察，獲取圖像，采用Image Lab軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，記錄灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。重復(fù)3次試驗(yàn)后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 觀察指標(biāo) 不同濃度DOX(0、10、100、200、400、800、1 600 μg/L)分別處理Saos-2和Saos-2/DOX細(xì)胞48 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算IC50和RI值；不同濃度DATS(0、10、50、100 μmol/L)處理Saos-2/DOX細(xì)胞，24、48、72 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；DOX 100 μg/L與DATS 10 μmol/L 單獨(dú)或聯(lián)合處理Saos-2/DOX細(xì)胞，24、48、72 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；不同濃度DATS(0、10、50、100 μmol/L)處理Saos-2/DOX細(xì)胞，48 h后，Western blotting法檢測(cè)pERK1/2、ERK1/2、pAKT1和AKT1蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 Saos-2/DOX耐藥細(xì)胞株的鑒定 不同濃度DOX分別處理Saos-2和Saos-2/DOX細(xì)胞48 h后， Saos-2的IC50值為(125.76±5.79)μg/L，Saos-2/DOX的IC50值為(873.27±9.16)μg/L，Saos-2/DOX細(xì)胞的RI值為6.94，說(shuō)明Saos-2/DOX為DOX的穩(wěn)定耐藥細(xì)胞株(RI值>3即為耐藥細(xì)胞株[8])。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度DOX處理48 h后Saos-2和Saos-2/DOX 細(xì)胞生存率的變化

2.2 DATS對(duì)Saos-2/DOX耐藥細(xì)胞株增殖的影響 不同濃度DATS處理Saos-2/DOX耐藥細(xì)胞，24、48、72 h后，DATS對(duì)Saos-2/DOX細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，且呈時(shí)間和劑量依賴性，見(jiàn)表2。其中，低濃度DATS(10 μmol/L)處理Saos-2/DOX細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為94.62%±1.85%，可視為非細(xì)胞毒性濃度，用于后續(xù)試驗(yàn)研究。

表2 不同濃度DATS處理后各時(shí)間點(diǎn)Saos-2/DOX細(xì)胞 生存率的變化

注：與0 μmol/L DATS相比，aP<0.05；與10 μmol/L DATS相比，bP<0.05；與50 μmol/L DATS相比，cP<0.05；與24 h比較，#P<0.05。

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)DATS、DOX單獨(dú)或聯(lián)合處理后Saos-2/DOX細(xì)胞生存率比較 DOX 100 μg/L處理Saos-2/DOX耐藥細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率與DATS 10 μmol/L處理后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DOX 100 μg/L與DATS 10 μmol/L聯(lián)合處理Saos-2/DOX耐藥細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率顯著低于DATS 10 μmol/L或DOX 100 μg/L單獨(dú)處理，且隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低(P均<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)DATS、DOX單獨(dú)或聯(lián)合處理 Saos-2/DOX細(xì)胞生存率比較

注： 與DOX 100 μg/L比較，aP<0.05；與DATS 10 μmol/L比較，bP<0.05；與24 h比較，#P<0.05。

2.4 不同濃度DATS 處理48 h后Saos-2/DOX細(xì)胞中pERK1/2、ERK1/2、pAKT1和AKT1蛋白表達(dá)比較 不同濃度DATS處理Saos-2/DOX細(xì)胞48 h后， ERK1/2、pAKT1和AKT1蛋白表達(dá)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，而pERK1/2蛋白表達(dá)水平隨濃度增高顯著增加(P均<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同濃度DATS處理48 h后Saos-2/DOX細(xì)胞中pERK1/2、 ERK1/2、pAKT1和AKT1蛋白表達(dá)比較

注：與0 μmol/L DATS相比，*P<0.05。

3 討論

骨肉瘤嚴(yán)重威脅兒童、青少年的生命健康，且80%患者就診時(shí)已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，其中以肺轉(zhuǎn)移最常見(jiàn)[9]。目前，根治性手術(shù)仍然是臨床上最常用的治療手段，然而僅接受根治性手術(shù)的患者術(shù)后預(yù)后并不樂(lè)觀，5年生存率僅15%～20%。術(shù)前給予患者8～12周新輔助化療(如大劑量DOX)，能夠顯著提高骨肉瘤患者的術(shù)后5年生存率和生存質(zhì)量[10]，但對(duì)化療藥物耐藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致骨肉瘤患者的長(zhǎng)期生存率降低，因此，尋找能夠有效逆轉(zhuǎn)化療耐藥的方案，是骨肉瘤相關(guān)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

蒽醌類抗生素是近三十年來(lái)研究較多、發(fā)展較快的一類抗腫瘤藥物，其中DOX被廣泛應(yīng)用于實(shí)體腫瘤和血液腫瘤的臨床治療。DOX主要通過(guò)抑制DNA復(fù)制，導(dǎo)致DNA損傷從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗癌藥效。然而，長(zhǎng)期應(yīng)用DOX可導(dǎo)致獲得性耐藥、劑量依賴性的不可逆嚴(yán)重心臟毒性等[11]，嚴(yán)重制約了DOX的臨床應(yīng)用。

有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中P-gp蛋白表達(dá)增加是導(dǎo)致骨肉瘤耐藥性產(chǎn)生的重要原因[12]。近年來(lái)，大量研究對(duì)此結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證和深入探討，如Li等[13]的體外研究發(fā)現(xiàn)，抑制DNA-PKcs導(dǎo)致P-gp表達(dá)下降，能夠增強(qiáng)骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性；此外，有研究顯示DATS可逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細(xì)胞中P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥性[7]，但并未對(duì)其他可能的DATS逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制進(jìn)行深入探討。

本研究采用間歇刺激法成功構(gòu)建對(duì)DOX耐藥的骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2/DOX，其RI值為6.94，且實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DATS具有抑制Saos-2/DOX細(xì)胞增殖的作用，呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性，其中10 μmol/L DATS干預(yù)細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為94.62%±1.85%，可視為非細(xì)胞毒性濃度，用于后續(xù)試驗(yàn)研究。100 μg/L DOX干預(yù)細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為98.38%±2.04%，而DOX 100 μg/L與DATS 10 μmol/L聯(lián)合處理Saos-2/DOX耐藥細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為69.65%±5.69%，顯著低于DATS或DOX單獨(dú)處理組，且此效應(yīng)具有時(shí)間依賴性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，非細(xì)胞毒性濃度的DATS能夠逆轉(zhuǎn)Saos-2/DOX耐藥細(xì)胞對(duì)DOX的耐藥性，增加化療敏感性。

DATS能夠抑制Saos-2/DOX耐藥細(xì)胞增殖，而ERK1/2和PKB/ AKT1是兩條非常重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，與腫瘤細(xì)胞異常增殖密切相關(guān)[14]。本研究采用不同濃度DATS干預(yù)Saos-2/DOX耐藥細(xì)胞48 h后，Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中ERK1/2、AKT1蛋白及其活化狀態(tài)的pERK1/2、pAKT1蛋白表達(dá)水平變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERK1/2、pAKT1和AKT1蛋白表達(dá)并無(wú)變化，而pERK1/2蛋白表達(dá)水平則顯著增加，且呈現(xiàn)濃度依賴性，以上結(jié)果提示，DATS抑制Saos-2/DOX耐藥細(xì)胞增殖、逆轉(zhuǎn)DOX耐藥可能是通過(guò)促進(jìn)ERK1/2蛋白激活實(shí)現(xiàn)的。ERK1/2在結(jié)腸癌、鼻咽癌等不同腫瘤細(xì)胞中均參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過(guò)程，并且在結(jié)腸癌、肺癌細(xì)胞中均有關(guān)于DATS促進(jìn)ERK1/2蛋白活化的報(bào)道[15]，以上研究均證實(shí)DATS能夠顯著增強(qiáng)ERK1/2磷酸化水平，進(jìn)而促進(jìn)ERK1/2蛋白激活，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述， DATS能夠抑制Saos-2/DOX耐藥細(xì)胞增殖，且具有時(shí)間和劑量依賴性，非細(xì)胞毒性濃度的DATS能夠逆轉(zhuǎn)Saos-2/DOX耐藥細(xì)胞對(duì)DOX的耐藥性，增加化療敏感性，且可能是通過(guò)增強(qiáng)ERK1/2磷酸化水平激活ERK1/2信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

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