宋祥云，劉金宇，耿巖玲，林云良，付瑞明，崔莉，王岱杰*

(1. 山東省分析測(cè)試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；2. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276006)

橙皮素(5, 7, 3′-三羥基-4′-甲氧基-黃烷酮)是一種重要的黃酮類(lèi)化合物，具有獨(dú)特的藥理活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域[1]。橙皮素具有健胃、祛痰、鎮(zhèn)咳、驅(qū)風(fēng)、利尿、抗病毒、止逆和止胃痛等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，橙皮素還具有抗氧化[2-4]、擴(kuò)張血管、降血脂[5]、抗癌[6-9]、抗炎[10]、改善血腦屏障[11-12]等多種藥理活性。

圖1 橙皮素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The chemical structure of hesperetin

橙皮素作為一種重要的藥物原料，在自然界中分布廣泛，同時(shí)也是多種植物產(chǎn)品的重要質(zhì)量控制指標(biāo)。目前市場(chǎng)上橙皮素以對(duì)照品為主，純度參差不齊，未按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性和定值實(shí)驗(yàn)，最終結(jié)果沒(méi)有不確定度評(píng)價(jià)，樣品也不具有溯源性。因此，為了滿足橙皮素及相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)需求，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性，本文按照GB /T 15000. 3—2008標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則[13]，成功研制出了橙皮素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品(圖1)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；SCIENTZ-10N型冷凍干燥儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)； LC-6A型制備液相色譜儀(日本島津公司)；WRS-1B型數(shù)字熔點(diǎn)儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；INOVA 600 MHz核磁共振波譜儀(美國(guó)瓦里安公司)；6520 Q-ToF型液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)；STA 449FC同步熱分析儀(德國(guó)耐馳公司)。

1.2 試劑與原料

柱層析硅膠、GF254薄層硅膠板(青島海洋化工廠)；高效液相色譜用甲醇為色譜純(美國(guó)天地公司)，水為重蒸水，其他試劑為分析純；橙皮素對(duì)照品(成都德思特生物技術(shù)有限公司)。

陳皮藥材購(gòu)自濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東省中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco的干燥成熟果皮，樣本存放于山東省分析測(cè)試中心。

1.3 樣品制備

1.3.1 橙皮素粗提物的提取

陳皮藥材粉碎至40目，95%乙醇加熱回流藥材3次，每次3 h，抽濾，減壓濃縮至無(wú)醇味，加水分散，分別用石油醚和乙酸乙酯萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚和乙酸乙酯浸膏，乙酸乙酯浸膏冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 橙皮素的富集

將乙酸乙酯浸膏進(jìn)行硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯溶劑體系梯度洗脫，分瓶收集，薄層色譜和HPLC監(jiān)測(cè)，橙皮素對(duì)照品比對(duì)，收集橙皮素含量較高的組分，減壓濃縮。

1.3.3 制備液相色譜分離

圖2 橙皮素單體的制備液相色譜圖Fig. 2 Chromatogram of hesperetin purified by prep arative HPLC

1.4 純度分析方法

1.4.1 高效液相色譜分析

1.4.2 薄層鑒別

1.4.3 熱重分析

精密稱(chēng)取樣品5 mg，置于熱重用坩堝中，熱重條件：初溫 30 ℃，最終溫度 600 ℃，升溫速率10 ℃/min，氣體N2，流量100 mL/min。

1.5 結(jié)構(gòu)表征

橙皮素單體的結(jié)構(gòu)表征采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)和核磁共振(NMR)等技術(shù)。UV 法的測(cè)試溶劑為甲醇，掃描范圍為200～400 nm；IR法采用KBr壓片，掃描波數(shù)為400～4 000 cm-1；MS為電噴霧離子源，載氣溫度為300 ℃，載氣流速為10 L/min，普氮為載氣，毛細(xì)管電壓為4.0 kV，掃描范圍m/z為100～1000；NMR法 的氘代試劑為CDCl3。

1.6 均勻性檢驗(yàn)

1.7 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

橙皮素樣品儲(chǔ)存溫度為0～4 ℃，考察樣品的1年穩(wěn)定期，分5個(gè)時(shí)間段監(jiān)測(cè)，按1.4.1中規(guī)定方法進(jìn)行分析，樣品純度讀取采用峰面積歸一化法，每份樣品測(cè)定6次，統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)法[13]。

1.8 定值

根據(jù)工作導(dǎo)則，標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值采用8 家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作進(jìn)行的方法。隨機(jī)抽取樣品24瓶，每家定值實(shí)驗(yàn)室寄出樣品3瓶，每瓶測(cè)定2次，協(xié)作實(shí)驗(yàn)室共出6個(gè)檢測(cè)結(jié)果，按1.4.1中規(guī)定方法進(jìn)行分析，樣品純度以峰面積歸一化法讀取[13-14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 純度分析

圖3 橙皮素等度洗脫HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of hesperetin by isocratic elution

2.2 結(jié)構(gòu)表征

2.3 均勻性檢驗(yàn)

將結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，確定橙皮素樣品的均勻性，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 1 Results of homogeneity test

表2 方差分析數(shù)據(jù)Table 2 Results of variance analysis

瓶間方差的計(jì)算公式：

則瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

u均=sbb=0.03%，

其中，u均為均勻性檢驗(yàn)不確定度。

F值的計(jì)算公式：

F=MS瓶間/MS瓶?jī)?nèi)=2.16。

以組間自由度υ1=9和組內(nèi)自由度υ2=20為變量查F臨界值表，可知F0.05(9，20)=2.39，由于F值小于F臨界值，因此所研制的橙皮素標(biāo)準(zhǔn)樣品具有良好的均勻性。

2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

采用t檢驗(yàn)對(duì)穩(wěn)定性結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用直線模型，觀察斜率值變化情況，并進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 3 Results of stability test of

斜率計(jì)算公式如下：

截距計(jì)算公式如下：

直線模型的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

則s=0.20%。

斜率相關(guān)不確定度計(jì)算公式如下：

查表得自由度為n-2和95%置信水平(p=0.95)分布的t因子為3.182。

由于斜率變化的絕對(duì)值|b1|

因此，斜率變化不顯著，即橙皮素標(biāo)準(zhǔn)樣品在1年內(nèi)穩(wěn)定性良好。

穩(wěn)定性檢驗(yàn)的不確定度為：

u穩(wěn)=Sb×t=0.11%。

其中，u穩(wěn)為穩(wěn)定性檢驗(yàn)不確定度。

2.5 定值

根據(jù)各個(gè)協(xié)作實(shí)驗(yàn)室的反饋結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，并最終確定橙皮素標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 協(xié)作定值數(shù)據(jù)Table 4 Results of cooperative certification

測(cè)定結(jié)果總平均值的計(jì)算公式如下：

實(shí)驗(yàn)室平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

總平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

則多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值引入的不確定度為：

其中，u定為定值不確定度。

橙皮素標(biāo)準(zhǔn)樣品的不確定度有如下三部分組分：(1)均勻性檢驗(yàn)不確定度；(2)穩(wěn)定性檢驗(yàn)不確定度；(3)定值不確定度，這三部分不確定度分量互不相關(guān)，需將三種不確定度合成，即合成不確定度(U合成)為：

U合成2= u均2+ u穩(wěn)2+ u定2。

代入數(shù)據(jù)計(jì)算得U合成=0.13%。

置信區(qū)間95%時(shí)，k=2。

則橙皮素標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)展不確定度：

U擴(kuò)展=2U合成=0.13%×2=0.26%。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)橙皮素及相關(guān)產(chǎn)品缺乏國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的現(xiàn)狀，嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)規(guī)定的標(biāo)樣樣品研制規(guī)則，成功地研制出橙皮素標(biāo)準(zhǔn)樣品，并順利通過(guò)了專(zhuān)家驗(yàn)收。研制過(guò)程中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性進(jìn)行考察，并進(jìn)行方差分析；穩(wěn)定性檢驗(yàn)采用直線模型，并進(jìn)行了t檢驗(yàn)法考察；定值采用多家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作，對(duì)定值結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)三個(gè)方面引入的不確定度，進(jìn)行了不確定度的合成和擴(kuò)展，獲得了標(biāo)準(zhǔn)值為98.78%，置信度95%的不確定度為0.26%的橙皮素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品，具有樣品溯源性，可用于相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)方法評(píng)定和含量測(cè)定，填補(bǔ)了橙皮素標(biāo)準(zhǔn)樣品的國(guó)內(nèi)外空白。

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