鄭曉文，邴帥，劉政，陳文華，譚會(huì)穎，徐凌川

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

鬼針草屬(BidensL.)植物隸屬于菊科(Compositae)管狀花亞科(Arduoideae Kitam.)向日葵族(Trib.Heliantheae Cass.)，為一年生的草本植物。鬼針草屬植物在全世界大致有230～240種，分布在熱帶以及溫帶地區(qū)，其中分布種類最豐富的地區(qū)是美洲[1-3]。該屬植物中國(guó)各地均有分布，在路邊和農(nóng)田中常見，是民間常用草藥[4-6]。

2015—2017年，我們?cè)谇鄭u、臨沂、濟(jì)南分別采到一種鬼針草屬植物，此植物特別高大，在葉形等方面與鬼針草屬其他種有明顯區(qū)別。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，本文對(duì)原植物在植物形態(tài)、顯微鑒別、分子鑒別等方面進(jìn)行了研究。

1 材料與儀器

1.1 材料

原植物經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室徐凌川教授鑒定并定名為高大鬼針草(BidensproceraL.C.Xu ex X.W.Zheng)，憑證標(biāo)本均保存于山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室(SDCM)。

1.2 儀器

YXJ-2離心機(jī)(常州國(guó)華電器有限公司)；SW-CJ-1D潔凈工作臺(tái)(上海鼎科科學(xué)儀器有限公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Bresser公司)；IB-5型離子濺射儀(日本EIKO公司)；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(天津金思德生物技術(shù)有限公司)；SUPRATM55 熱場(chǎng)掃描電子顯微鏡(德國(guó)蔡司公司) ；水合氯醛、濃鹽酸、間苯三酚等試劑均為分析純；娃哈哈純凈水

2 方法

2.1 形態(tài)鑒別

對(duì)植物的外觀形態(tài)進(jìn)行觀察，對(duì)其形態(tài)特征進(jìn)行描述。

2.2 顯微鑒別

制作莖的臨時(shí)切片時(shí)，采用徒手切片法切片，后加間苯三酚試液1～2滴，稍放置，再加濃鹽酸1滴染色，在顯微鏡下觀察。

制作葉下表皮的臨時(shí)裝片，采用葉表皮制片法做葉下表皮的水裝片，顯微鏡下觀察其顯微特征。

制作粉末的臨時(shí)裝片時(shí)，采用粉末制片法制作莖、花、葉的粉末透化片，觀察組織構(gòu)造與粉末特征并繪圖[7]。

將高大鬼針草的花粉均勻放置在粘有雙面導(dǎo)電膠的掃描電鏡標(biāo)本臺(tái)上，經(jīng)IB-5型離子濺射儀噴金后，在熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察花粉粒形態(tài)，并對(duì)花粉粒進(jìn)行拍照?；ǚ哿Ｐ螤钣蓸O軸與赤道軸的比值決定，P/E的值在0.88～1.14之間為近球形，花粉粒大小由極軸與赤道軸(P×E)來(lái)決定[8]，刺狀突起的密度按100 μm2的刺狀突起個(gè)數(shù)表示。

2.3 分子鑒別

通過試劑盒法提取高大鬼針草的基因組DNA，經(jīng)PCR反應(yīng)程序，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后，對(duì)核糖體DNA ITS區(qū)域的堿基序列進(jìn)行測(cè)定，記錄高大鬼針草DNA的ITS堿基序列。

3 結(jié)果

3.1 原植物形態(tài)

一年生草本植物，高70～220 cm。莖直立，表面綠色，為四棱形，稍扁，有縱條紋，有稀疏短毛或無(wú)毛，四周向內(nèi)凹陷，斷面深綠色，中間髓為白色。葉草質(zhì)，葉脈為羽狀網(wǎng)脈，葉上表面有稀疏的白色短毛，葉下表面有密集的白色柔毛，較上表面長(zhǎng)且多，葉柄長(zhǎng)，背面微凸，正面有溝，溝內(nèi)及邊緣有稀疏的白色柔毛，葉柄基部有白色柔毛，葉味苦、有清香；上部葉二回或一回羽狀分裂，互生或?qū)ι胁咳~最大，二至四回羽狀分裂，對(duì)生，頂生裂片為條狀披針形，無(wú)或具1～3個(gè)不規(guī)則粗齒，下部葉二至三回羽狀分裂，對(duì)生，頂生裂片為三角狀或菱狀披針形，邊緣有不規(guī)整的粗齒。頭狀花序單生莖端和枝端，連同總苞苞片直徑4～5 mm，高約4～7 mm。舌狀花黃色，有2～4枚；總苞鐘狀或杯形，外層苞片7～9枚，通常為8枚，倒卵狀披針形，葉狀，草質(zhì)，被柔毛，邊緣有緣毛，內(nèi)層苞片通常10枚，披針形，膜質(zhì)，長(zhǎng)6～7 mm，具淡黃色邊緣，無(wú)舌狀花，筒狀花兩性，黃色，花冠長(zhǎng)約5 mm，冠檐5裂；瘦果條形，具四棱，黑褐色，長(zhǎng)約0.6～1.5 cm、寬約0.4～0.8 mm(不包括芒刺)，兩端漸漸狹窄，表面有淡黃色短毛或者瘤狀突起，頂端芒刺4枚，長(zhǎng)約0.1～0.2 cm，具倒刺毛，果基圓形，淡黃褐色，向背面傾斜?；ㄆ跒?～9月，果期為6～11月。

3.2 顯微鑒別

3.2.1 莖橫切面

呈方形，四角有明顯棱脊。表皮細(xì)胞為一列細(xì)胞，沿切線延長(zhǎng)。皮層窄，由5～7列薄壁細(xì)胞組成，排列較為疏松，有數(shù)列厚角組織。內(nèi)皮層為一列細(xì)胞。韌皮部纖維束多呈半月形，斷續(xù)排列。維管束為無(wú)限外韌型，大小不等，16～24個(gè)環(huán)列，其中一組對(duì)邊維管束較另一組發(fā)達(dá)，韌皮部細(xì)胞狹窄，形成層成環(huán)，木質(zhì)部斷續(xù)呈環(huán)狀排列，木質(zhì)部導(dǎo)管2～6個(gè)并列徑向排列。髓部較寬廣，由薄壁細(xì)胞組成，約占莖部橫切面的2/3。見圖1。

1表皮；2皮層； 3厚角組織；4中柱鞘纖維； 5韌皮部；6形成層；7木質(zhì)部； 8髓；9內(nèi)皮層。圖1 高大鬼針草莖的橫切面圖Fig.1 Transverse section of stem of Bidens procera L.C.Xu ex X.W.Zheng

3.2.2 葉下表皮

葉表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，側(cè)壁呈波紋狀彎曲，互相鑲嵌。氣孔類型為不定式或不等式，副衛(wèi)細(xì)胞約3～5個(gè)細(xì)胞。表皮細(xì)胞非腺毛多見，約4～12個(gè)細(xì)胞。見圖2。

圖2 高大鬼針草葉下表皮圖Fig.2 The lower epidermis of the leaf of Bidens procera L.C.Xu ex X.W.Zheng

3.2.3 粉末

黃綠色。纖維眾多。非腺毛為線狀毛，單細(xì)胞或2～15個(gè)細(xì)胞組成。導(dǎo)管多見螺紋，少見梯紋、環(huán)紋導(dǎo)管。葉碎片表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，側(cè)壁呈波紋狀彎曲、彼此互相鑲嵌、大小不等，氣孔類型為不定式或不等式?；ǚ哿A球形，表面為刺狀紋飾。草酸鈣方晶少見。少見色素塊。見圖3。

1表皮細(xì)胞及氣孔； 2非腺毛； 3冠毛；4導(dǎo)管；5纖維；6花粉粒；7花粉囊內(nèi)壁細(xì)胞。圖3 高大鬼針草粉末特征圖Fig.3 Characteristic chart of powder of Bidens procera L.C.Xu ex X.W.Zheng

3.2.3 花粉粒的觀察

花粉粒近球形，極軸25.61 μm(24.94～26.27 μm)，赤道軸20.73 μm(20.31～21.14 μm)，極赤比為1.24(1.21～1.26)；花粉粒大小是25.61 μm(24.94～26.27 μm)×20.73 μm(20.31～21.14 μm)；極面觀為三裂圓形，赤道觀為近圓形，萌發(fā)孔為三孔溝；外壁紋飾：刺狀突起、刺漸尖、刺長(zhǎng)4.72 μm(4.58～4.86 μm)、刺密度4.20(4.05～4.53)，基部膨大、有少量閉孔，基部寬4.21 μm(4.09～4.34 μm)，座間有大量疣狀突起(括號(hào)外是各參數(shù)的均數(shù)，括號(hào)內(nèi)是均數(shù)的95%置信區(qū)間)。見圖4。

圖4 高大鬼針草花粉粒的掃描電鏡圖Fig.4 SEM figure of Bidens procera L.C.Xu ex X.W.Zheng

3.3 DNA的ITS序列

本次實(shí)驗(yàn)測(cè)得原植物DNA的ITS序列為：

GGGGTGTCTTGATCTTGGCCTAGCTGATCGACTCGTGTACATGTACTTACACCTGGCTTT

GCGAGGACCAAAGCTCTTGTTTTGAGCCTCGTAAAGCCTTGTTGGCCTGCATTTAGGGCC

GCCCCTCGGGGTGTCCTGGATGTAGGTCGACACAACTAACAATTCGGCACAACACGTGCC

AAGGAAAACATTACTTAAAGGGCCCGTGCCATGTCGCCCCGTTTACGGCAAGCGCGTTGC

ACGTGGCCTCTTTGTAACCCTAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCACGCATCG

ATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGA

GTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTCTGGCTGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTC

ACGCATCACGTCGCCCCCACCATCCATCCCTTCTCGGGACATGTTGGTGTGGGGCGGAGA

TTGGTCTCCTGTGCCATGGCACGGTTGACCTAAATAGAAGTCCCCTCATGAGTGACGCAC

GACTAGTGGTGGTTGATAAGACTGTCGTATCGTGTCGTGCGTTCGTTTCATGCGGGCTTG

ACTCCTTGTAAAACCCACATGTGTTGTCCTGTGACGATGCTTCGATCGCGACCCCAGGTC

AGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAAAAACCGGAGGAAA

將本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果在National Center for Biotechnology Information中的Gen Bank上經(jīng)Blast后進(jìn)行同源率分析，對(duì)比結(jié)果顯示，與原植物的同源率最高的植物是婆婆針，同源率為89%，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室徐凌川教授鑒定為鬼針草屬植物高大鬼針草(BidensproceraL.C.Xu ex X.W.Zheng)。

4 小結(jié)與討論

通過對(duì)原植物DNA的ITS堿基序列在NCBI中進(jìn)行同源率分析鑒定后，結(jié)果顯示與高大鬼針草同源率最高的植物是婆婆針。其與中國(guó)鬼針草屬植物型態(tài)異同點(diǎn)見表1。

表1 中國(guó)鬼針草屬植物葉、瘦果以及芒刺等特征的異同點(diǎn)Table 1 The similarities and differences of characteristics in leaves、achenes and prickles of Bidens L. from China

通過對(duì)高大鬼針草莖以及葉的形態(tài)、性狀、顯微特征進(jìn)行系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)高大鬼針草形態(tài)的鑒別要點(diǎn)是全株高70～220 cm。莖直立，表面綠色，為四棱形，有縱條紋。葉草質(zhì)，葉脈為羽狀網(wǎng)脈，葉柄長(zhǎng)。頭狀花序，總苞鐘狀或杯形，舌狀花黃色，筒狀花兩性；瘦果條形，具四棱，黑褐色，頂端芒刺四枚，具倒刺。顯微特征的鑒別要點(diǎn)是：(1)莖橫切面特征：莖表皮細(xì)胞為一列細(xì)胞；皮層窄，韌皮部纖維束多呈半月形，維管束為無(wú)限外韌型，韌皮部細(xì)胞狹窄，形成層成環(huán)，木質(zhì)部斷續(xù)呈環(huán)狀排列；髓部寬廣。(2)葉下表皮特征：葉表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，側(cè)壁呈波紋狀彎曲；氣孔類型為不定式或不等式；表皮細(xì)胞非腺毛多見。粉末特征：非腺毛為線狀毛；導(dǎo)管多見螺紋，少見梯紋、環(huán)紋導(dǎo)管；花粉粒圓球形，表面為刺狀紋飾，萌發(fā)孔為三孔溝。

本文的鑒定方法簡(jiǎn)便、易操作，得到了高大鬼針草重要的生藥學(xué)鑒定特征，為高大鬼針草的生藥學(xué)鑒定以及進(jìn)一步的深入研究與利用提供了可靠的依據(jù)。

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