梁珍珍，陳 亮（上海市嘉定區(qū)安亭鎮(zhèn)黃渡社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心中醫(yī)科201805）

阿爾茨海默病（AD）是一種以進(jìn)行性的學(xué)習(xí)記憶能力下降及認(rèn)知功能損害為主要表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。以往研究表明，調(diào)心方對(duì)改善AD相關(guān)指標(biāo)及臨床癥狀有一定療效，尤其在改善學(xué)習(xí)記憶能力方面具有較明顯的作用[1?4]。但對(duì)于調(diào)心方干預(yù)AD早期學(xué)習(xí)記憶下降的研究鮮有開展。針對(duì)AD一旦發(fā)生，其病理過程將不可逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)，開展對(duì)AD治療時(shí)間前移方法的研究，變得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)通過小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試及海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）技術(shù)進(jìn)一步探討調(diào)心方干預(yù)AD學(xué)習(xí)記憶下降這一早期臨床表現(xiàn)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 調(diào)心方（黨參20 g，桂枝12 g，菖蒲12 g，白芍 20 g，甘草 6 g，龍骨 60 g，遠(yuǎn)志 12 g）由上海市中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所自制，鹽酸多奈哌齊片劑購(gòu)自衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20050978。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Morris水迷宮，成儀生物信號(hào)采集系統(tǒng)（成都儀器廠），小鼠立體定位儀（NARISHIGE/JA?PAN，09013），多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)RM6240型，ESCORTⅢ型牙科鉆，玻璃電極拉制器（NARISHIGE/JAPAN，PE?22 型）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因3月齡小鼠，體重（20±5）g，共 30 只，由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)：SCXK1蘇/20100?001），隨機(jī)分為模型組、中藥組、西藥組，每組10只；另將C57野生型小鼠8只作為對(duì)照組，由南方模式動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)：SCCK 滬/2010?0017）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)給藥 將調(diào)心方顆粒劑（3.5 g/kg）、多奈哌齊片劑（1.67 mg/kg）分別溶于168 mL生理鹽水中，分別給予中藥組和西藥組小鼠每天0.2 mL灌胃；其中模型組給予等量生理鹽水灌胃，對(duì)照組不干預(yù)，周期均為12周。

1.2.2 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試 采用Morris水迷宮[5]，將水迷宮平臺(tái)設(shè)于東南象限正中位置，水池水位高出平臺(tái)1 cm，水溫保持在19～24℃。電腦計(jì)時(shí)設(shè)定為70 s，各組小鼠頭部作白色標(biāo)記后，開始測(cè)試。將小鼠放于平臺(tái)站立5 s后，從正北象限放入水池中，若小鼠在規(guī)定時(shí)間70 s未找到平臺(tái)，則電腦自動(dòng)計(jì)時(shí)潛伏期為70 s；若小鼠提前找到平臺(tái)，則電腦自動(dòng)計(jì)時(shí)小鼠潛伏期為找到平臺(tái)所用時(shí)間。然后再將小鼠從正西象限重復(fù)此操作，記錄小鼠潛伏期。如此每天訓(xùn)練2次，連續(xù)訓(xùn)練5 d，記錄各組小鼠潛伏期。

1.2.3 小鼠海馬CA1區(qū)LTP記錄

1.2.3.1 電極制備 用玻璃電極拉制器拉制阻抗為3～5 MΩ的玻璃電極，以3 mol/L的KCl液體為電極液注入玻璃電極管內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)以玻璃電極管尖端在放大鏡下看不到氣泡為準(zhǔn)，然后將備好的銀絲插入玻璃電極管內(nèi)，制備記錄電極；刺激電極為兩根直徑0.1 mm的絕緣銅絲組成的同心圓雙電極，使用之前對(duì)其導(dǎo)電性能進(jìn)行檢測(cè)；參考電極為臨床用1寸針灸針。

1.2.3.2 小鼠麻醉及定位 小鼠用20%烏拉坦（由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）按照13 g/kg體重行腹腔注射麻醉后，將小鼠立體定位儀按要求安裝完成，用耳桿將小鼠頭部水平固定于小鼠立體定位儀上，保持小鼠呼吸通暢，用手術(shù)剪剪開小鼠頭部皮膚，充分暴露顱骨，清除顱骨上的筋膜。用中性筆在小鼠顱骨十字縫處作一標(biāo)記，開始定位。記錄電極位于海馬CA1區(qū)，定位參數(shù)為前囟后2.0 mm，中線旁開1.4 mm，刺激深度為硬腦膜下1.5 mm；刺激電極位于同側(cè)海馬CA3區(qū)，定位參數(shù)為前囟后3.8 mm，中線旁開3.0 mm，刺激深度為硬腦膜下1.5 mm[6]。定位完成后，用牙科鉆按照定位標(biāo)記輕輕鉆開顱骨，將刺激電極與記錄電極依次下到硬腦膜下1.5 mm處，參考電極插于小鼠頭部皮膚處，開始記錄。

1.2.3.3 高頻刺激（HFS）誘導(dǎo)參數(shù) 將刺激器設(shè)定為強(qiáng)度遞增刺激，強(qiáng)度為0.5 V，波寬0.1 ms，強(qiáng)度增量0.5 V，延時(shí)20 ms，進(jìn)行連續(xù)單刺激，以產(chǎn)生最大誘發(fā)波群峰電位（PS）幅值的1/2所對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度作為刺激強(qiáng)度?；A(chǔ)記錄采用程控刺激，基礎(chǔ)記錄參數(shù)為：波寬0.1 ms，脈沖數(shù)1個(gè)，組間延時(shí)20 ms，循環(huán)60次，低通濾波1 000 Hz。待基礎(chǔ)記錄穩(wěn)定30 min后，用同等刺激強(qiáng)度的HFS誘發(fā)LTP，采用程控刺激，刺激參數(shù)為：波寬0.1 ms，脈沖數(shù) 30個(gè)，組間延時(shí)20 ms，循環(huán) 120次，低通濾波1 000 Hz。

1.2.3.4 誘發(fā)基礎(chǔ)波形 記錄HFS后，觀察PS幅值，如果PS幅值較自身基礎(chǔ)刺激PS幅值增強(qiáng)10%以上且持續(xù)時(shí)間超過30 min，則表明LTP現(xiàn)象已經(jīng)形成，連續(xù)記錄60 min。PS幅值測(cè)量方法見圖1。

圖1 PS幅值測(cè)量方法

1.2.2.5 數(shù)據(jù)分析處理 每只小鼠刺激前30 min產(chǎn)生60個(gè)PS幅值，以其平均值作為基礎(chǔ)值，刺激前與刺激后共180個(gè)PS幅值按每10個(gè)PS幅值求1個(gè)平均值，將其與基礎(chǔ)值作比較所得出的相對(duì)值（%）作為本次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)。多組組內(nèi)比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠 實(shí)驗(yàn)過程中，西藥組小鼠自然死亡2只，LTP實(shí)驗(yàn)過程中，由于手術(shù)等原因每組小鼠均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，最終LTP實(shí)驗(yàn)結(jié)果中每組均納入5只小鼠。

2.2 調(diào)心方對(duì)各組小鼠水迷宮潛伏期的影響 對(duì)照組、中藥組、西藥組小鼠隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，水迷宮潛伏期時(shí)間均呈逐漸縮短趨勢(shì)，而模型組小鼠潛伏期時(shí)間無(wú)明顯變化。與對(duì)照組小鼠比較，模型組小鼠潛伏期時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；與模型組小鼠比較，中藥組、西藥組小鼠經(jīng)過4 d的訓(xùn)練期，其潛伏期時(shí)間明顯縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。

2.3 調(diào)心方對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)LTP的影響 各組小鼠在給予高頻刺激后，成功誘導(dǎo)出LTP（PS幅值增幅達(dá)10%以上且維持30 min以上）。與對(duì)照組PS增幅比較，模型組PS幅值增幅在各個(gè)時(shí)段明顯降低，LTP受抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組PS幅值增幅在各個(gè)時(shí)段明顯增強(qiáng)，LTP水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05）；西藥組與模型組的PS幅值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，調(diào)心方可以改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的LTP水平，從而改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，而西藥組改善LTP方面的作用并不明顯。各組小鼠高頻刺激后LTP結(jié)果見表2，各組小鼠LTP趨勢(shì)圖見圖2。

表1 調(diào)心方對(duì)各組小鼠水迷宮潛伏期的影響（±s，s）

表1 調(diào)心方對(duì)各組小鼠水迷宮潛伏期的影響（±s，s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05

第1天62.4±11.63 69.5±1.58a 67.5±7.91 70.0±0.00組別對(duì)照組模型組中藥組西藥組第5天43.3±23.29 70.0±0.00b 52.5±17.83c 56.1±18.52c n8 1 0 10 8第2天48.3±15.28 67.2±8.85b 70.0±0.00 70.0±0.00第3天49.6±18.53 67.2±5.98b 70.0±0.00 63.5±12.46第4天49.3±22.02 67.7±6.00a 64.3±15.13 66.0±11.31

表2 高頻刺激后各時(shí)間點(diǎn)各組小鼠海馬CA1區(qū)群PS幅值變化（±s，%）

表2 高頻刺激后各時(shí)間點(diǎn)各組小鼠海馬CA1區(qū)群PS幅值變化（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

20 min 160.3±14.83 112.0±2.24a 133.5±10.41c 119.4±11.41組別對(duì)照組模型組中藥組西藥組60 min 193.7±41.14 115.4±8.29a 136.1±13.88b 122.7±20.66 n5 5 5 5 10 min 152.8±14.43 110.3±3.24a 138.6±14.93c 125.0±18.01 30 min 168.7±28.16 114.5±8.10a 134.2±10.23b 121.0±15.75 40 min 176.5±26.98 115.2±8.31a 135.5±13.06b 126.3±26.33 50 min 188.2±35.79 116.2±7.91a 135.6±10.11b 128.0±25.30

圖2 各組小鼠LTP趨勢(shì)圖

3 討 論

海馬電生理具有很強(qiáng)的可塑性，這種可塑性主要表現(xiàn)為L(zhǎng)TP和長(zhǎng)時(shí)程抑制（LTD）。近年來(lái)，有關(guān)LTP的研究逐漸成為研究學(xué)習(xí)記憶障礙的熱點(diǎn)。神經(jīng)細(xì)胞之間突觸的可塑性是學(xué)習(xí)與記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，與海馬神經(jīng)元的功能密切相關(guān)。海馬神經(jīng)元是大腦學(xué)習(xí)記憶能力得以發(fā)揮的基礎(chǔ)[7]，而神經(jīng)電生理的持久改變是學(xué)習(xí)與記憶得以長(zhǎng)期維持的電生理基礎(chǔ)[8]，海馬LTP作為與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的電生理現(xiàn)象，是突觸傳遞功能可塑性的重要表現(xiàn)形式之一，是研究海馬記憶功能的重要指標(biāo)[9]。有研究表明，LTP損傷是APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知損害的一個(gè)重要指標(biāo)[10]，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)成為研究AD的理想模型[11?12]，本模型中小鼠2～3個(gè)月皮質(zhì)和海馬發(fā)生膽堿能軸突腫脹，4～5個(gè)月開始在杏仁體和海馬出現(xiàn)一些嗜剛果紅斑塊，6個(gè)月以后在開始在大腦皮質(zhì)、海馬和杏仁體形成大量淀粉樣斑塊。3月齡時(shí)小鼠正處于病理特征尚未形成或僅有少量形成時(shí)期，但已出現(xiàn)記憶下降階段，是研究AD超早期臨床特征的理想時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)中采用Morris水迷宮對(duì)小鼠AD早期空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測(cè)，模型組水迷宮潛伏期較對(duì)照組潛伏期時(shí)間明顯縮短，中藥級(jí)、西藥組水迷宮潛伏期較模型組潛伏期時(shí)間明顯縮短，其結(jié)果顯示模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力較對(duì)照組明顯降低，中藥調(diào)心方在改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力方面具有顯著作用。表明調(diào)心方在超早期干預(yù)AD學(xué)習(xí)記憶下降中，具有預(yù)防AD向中晚期發(fā)展的趨勢(shì)。本研究LTP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在給予高頻刺激后，各組小鼠的PS幅值增強(qiáng)都達(dá)到10%以上，成功誘導(dǎo)出LTP。其中模型組PS幅值增幅在第60分鐘呈下降趨勢(shì)，說明學(xué)習(xí)記憶下降對(duì)LTP PS幅值的維持具有一定影響；西藥組PS幅值增幅在高頻刺激后其增長(zhǎng)趨勢(shì)不穩(wěn)定，而中藥組的增長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)穩(wěn)定，在第60分鐘依然呈上升趨勢(shì)，說明中藥調(diào)心方在改善學(xué)習(xí)記憶方面作用穩(wěn)定。給予高頻刺激后，西藥組PS幅值增強(qiáng)達(dá)120%以上，中藥組PS幅值增強(qiáng)達(dá)130%以上，西藥組與模型組比較無(wú)明顯差異，中藥組與模型組比較，差異顯著。調(diào)心方在改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠LTP水平上，具有較顯著作用，至于西藥組對(duì)LTP的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討、研究。以上研究結(jié)果在以調(diào)心方治療AD有效的基礎(chǔ)上，將其治療時(shí)間前移，進(jìn)一步證實(shí)了調(diào)心方在治療早期學(xué)習(xí)記憶能力下降中的作用，為調(diào)心方運(yùn)用于AD預(yù)防治療提供了重要參考。

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