任明亮，李輝，劉冬斌，陳國雄，譚鎮(zhèn)南，劉鵠(南方醫(yī)科大學附屬南海醫(yī)院，廣東佛山528200)

骨肉瘤是起源于間葉組織的常見原發(fā)骨組織惡性腫瘤，大約占骨組織原發(fā)腫瘤的20%，好發(fā)于青少年，惡性程度高，易早期發(fā)生肺轉移[1，2]。由于骨肉瘤的高侵襲性和轉移性，患者預后較差。因此探索骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展機制，尋找骨肉瘤基因治療的有效靶點意義重大。叉頭框(FOX)蛋白O是FOX蛋白家族中的一個重要的亞家族，包括FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6，在人體各種正常組織細胞中廣泛表達，參與細胞分化、增殖、代謝、凋亡、信號傳導、免疫等重要功能[3]。FOXO1基因定位于13號染色體13q13～14.1。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1在前列腺癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]、肝癌[7]等多種惡性腫瘤組織中表達下調，作為一種腫瘤抑制因子參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但目前有關FOXO1在骨肉瘤細胞中的表達變化及作用機制的研究較少。2017年6月～2017年9月，本研究探討FOXO1表達上調對骨肉瘤細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 人骨肉瘤細胞系MG-63及人成骨細胞系hFOB1.19均購自美國ATCC公司。TRIzol Reagent和LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒購自日本Takara公司；FOXO1和GAPDH引物、包含F(xiàn)OXO1編碼區(qū)的pcDNA3.1-FOXO1重組質粒和空載質粒由上海生工生物公司設計合成；一抗FOXO1和GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司，二抗購自武漢博士德生物公司；CCK-8試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所；Anexin-FITC/PI凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司。

1.2 FOXO1基因轉染 人骨肉瘤細胞系MG-63、人成骨細胞系hFOB1.19均用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期MG-63細胞，并隨機分為FOXO1重組質粒組與NC組，采用LipofectamineTM2000按照說明書操作分別轉染pcDNA3.1-FOXO1重組質粒和空載質粒。

1.3 MG-63細胞中FOXO1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。轉染后24 h，用TRIzol試劑提取兩組細胞總RNA。取總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書操作逆轉錄合成cDNA，低溫保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板，參照qRT-PCR試劑盒說明書，應用實時熒光定量PCR 儀進行定量PCR檢測。FOXO1 正向引物： 5′-AACCTGGCATTACAGTTGGCC-3′、反向引物：5′-AAATGCAGGAGGCATGACTACGT-3′，GAPDH 正向引物：5′-GGTGATGCTGGTGCTGAGTA-3′、反向引物：5′-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算FOXO1 mRNA的相對表達量。

1.4 MG-63細胞中FOXO1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。轉染后24 h收集兩組細胞，蛋白裂解液提取細胞總蛋白，Bradford法行蛋白定量。各組取蛋白樣品上樣30 μg，行SDS-PAGE電泳分離，電轉移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h，加入FOXO1(1∶500)一抗和GAPDH一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜，洗膜后再加入二抗,室溫孵育1 h，ECL顯影液顯影后凝膠成像儀曝光拍照，灰度掃描儀分析條帶灰度值。FOXO1蛋白的相對表達量=FOXO1蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.5 MG-63細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。轉染后24 h取各組細胞接種于96孔細胞板，隔24 h向每孔加入CCK-8液10 μL，每孔設置4個復孔，并設置空白對照，于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，終止孵育后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔450 nm 波長處吸光度值。用吸光度值表示細胞的增殖能力。

1.6 MG-63細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。轉染后48 h取各組細胞，制備1×106/mL的細胞懸液。每組取細胞懸液5 mL置于流式管中，依次加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL，混勻后室溫下避光染色15 min，用流式細胞儀進行檢測，計算細胞凋亡率。

2 結果

2.1 人骨肉瘤細胞中FOXO1 mRNA的表達 人骨肉瘤細胞MG-63和人成骨細胞hFOB1.19中FOXO1 mRNA相對表達量分別為0.21±0.10、1.02±0.04。FOXO1 mRNA在人骨肉瘤細胞MG-63中的相對表達量低于人成骨細胞hFOB1.19(P<0.05)。

2.2 轉染后MG-63細胞內FOXO1 mRNA、蛋白表達變化 轉染后24 h，F(xiàn)OXO1重組質粒組與NC組FOXO1 mRNA相對表達量分別為10.50±0.48、1.04±0.06，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；FOXO1重組質粒組與NC組FOXO1蛋白相對表達量分別為1.98±0.22、0.19±0.09，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 FOXO1過表達對MG-63細胞增殖能力的影響 轉染后48、72、96 h，F(xiàn)OXO1重組質粒組吸光度值分別為0.52±0.06、1.08±0.14、1.36±0.13，NC組分別為1.06±0.14、1.99±0.22、2.72±0.20，兩組不同時間點吸光度值比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.4 FOXO1過表達對MG-63細胞凋亡率的影響 FOXO1重組質粒組、NC組細胞凋亡率分別為17.34%±1.04%、5.48%±0.38%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義﹙P<0.05﹚。

3 討論

FOXO1亦稱FKH1或FKHR，是FOXO家族的重要成員之一，其轉錄活性受泛素化、磷酸化、乙?；韧緩秸{節(jié)，是PI3K、MAPK、IKK等信號轉導通路中的關鍵信號分子[8]，在人體各種正常組織細胞中廣泛表達，在機體細胞增殖、細胞凋亡和分化、抗氧化應激等多種重要的細胞功能調控中發(fā)揮重要的作用[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1表達降低與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。FOXO1在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著抑癌基因的生物學功能[10]。陳寶英等[11]研究證實，F(xiàn)OXO1在乳腺癌組織中表達降低，F(xiàn)OXO1的表達變化與腋窩淋巴結轉移、腫瘤大小密切相關。Wang等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1在肝細胞癌組織中表達降低，通過影響核糖體、剪接體、類固醇的合成影響蛋白的合成，在肝細胞癌變和肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但目前有關FOXO1在骨肉瘤組織中的表達變化研究甚少，且作用機制尚未明確。本研究結果顯示，F(xiàn)OXO1 mRNA在骨肉瘤細胞MG-63中的表達也較成骨細胞hFOB1.19降低，提示FOXO1低表達在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。

細胞無限增殖和凋亡受阻導致的增殖/凋亡平衡失衡是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制[13]。近年來多項研究已證明FOXO1能夠抑制多種惡性腫瘤細胞的增殖，促進其凋亡，從而發(fā)揮著抑癌基因的作用。Li等[14]報道人肝癌細胞中水通道蛋白9能夠抑制PI3K/Akt通路，上調細胞中FOXO1的表達，從而抑制癌細胞增殖并促進其凋亡。Zhao等[15]發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過抑制PI3K/Akt通路激活FOXO1，誘導胰腺癌細胞凋亡。Yang等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)FOXO1在肝細胞癌細胞中表達降低，miR-1269在肝細胞癌中表達增高，miR-1269通過抑制FOXO1的表達促進癌細胞增殖。本研究將重組質粒pcDNA3.1-FOXO1轉染至骨肉瘤MG-63細胞，上調細胞中FOXO1的表達，結果顯示轉染后骨肉瘤細胞增殖能力下降。進一步通過流式細胞術檢測轉染后MG-63細胞凋亡情況，結果顯示轉染后骨肉瘤細胞凋亡率上升。以上提示在骨肉瘤細胞中FOXO1也起著抑癌基因的作用，上調FOXO1的表達能夠抑制骨肉瘤細胞的增殖并促進其凋亡，抑制骨肉瘤的進展。

綜上所述，F(xiàn)OXO1在骨肉瘤細胞中呈低表達，上調骨肉瘤細胞中FOXO1的表達能夠抑制細胞增殖，促進其凋亡。這為骨肉瘤的靶向治療提供了可能的有效靶點。

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