龐永志，尹靜，王晉，李大魯(濟南市口腔醫(yī)院，濟南250000)

多種口腔常見病(牙周炎、外傷、腫瘤等)均可造成局部牙槽骨缺損，臨床修復(fù)治療困難，且病程長。隨著國人生活水平及醫(yī)療水平的提高，牙齒種植已在臨床普遍推廣。然而越來越多的患者面臨骨量不足的問題。研究探尋理想的牙槽骨再生和修復(fù)的生物材料是口腔醫(yī)學研究的熱點與難點。臨床急需一種性能與自體骨類似，植入后最終能被爬行替代的人工骨材料。為解決這一臨床難題，首先需要選擇合適的動物來構(gòu)建牙槽骨缺損模型，為研究骨替代材料奠定基礎(chǔ)。猴、猩猩等靈長類動物牙槽骨與人類最相似，但其價格較高，飼養(yǎng)管理難度較大，難以推廣造模；鼠類因個體較小，手術(shù)操作不便。成年新西蘭大白兔個體適中，性情溫順，價格便宜，便于飼養(yǎng)。兔以前牙抓取切斷食物，以磨牙為咀嚼中心進食，所以在其第一磨牙與中切牙之間制作骨缺損，避免因手術(shù)造成進食困難，影響研究結(jié)果。目前國內(nèi)有關(guān)建立局部牙槽骨缺損模型的研究較少，而在相關(guān)研究牙槽骨缺損修復(fù)材料的實驗中制造牙槽骨缺損的方法各異。2016年11月～2017年2月，本研究建立兔局部牙槽骨缺損模型，為骨移植材料在牙槽骨缺損的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 健康純種普通級新西蘭大白兔20只，3月齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg、平均2.36 kg，雌雄不限，購自濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心，許可證號SCXK(魯)20100005，飼養(yǎng)于山東省千佛山醫(yī)院實驗動物中心。分籠飼養(yǎng)，實驗室常規(guī)定期消毒，溫度維持20 ℃左右，相對濕度50%±2%，通風良好，按照標準進行飼養(yǎng)。所有動物口腔黏膜顏色正常，牙齒無損壞，舌活動自如。實驗過程中對動物的處置參照中華人民共和國科學技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》標準。戊巴比妥鈉(德國Merck公司)；AE240型電子分析天平(瑞士METTLER公司)、FSX100型光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、Lunar prodigy型雙能X線骨密度儀(美國GE公司)、KODAK2200型口腔X射線機(法國Trophy生產(chǎn))、EX-203型口腔慢速手機(日本NSK公司)、堿性磷酸酶試劑盒(美國sigma公司)、Sunrise型酶標儀(瑞士Tecan公司)、FSH-2A型高速勻漿機(國立常州實驗設(shè)備研究所)。

1.2 牙槽骨缺損動物模型建立 術(shù)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食12 h、禁水8 h。經(jīng)兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，麻醉后將其仰臥位固定于動物實驗臺上，術(shù)區(qū)常規(guī)消毒鋪巾，口內(nèi)再次消毒，手指觸摸到下頜體上緣黏膜最薄處，于第一磨牙近中齦緣前方約5 mm與切牙遠中齦緣后方約5 mm之間用11號尖刀片切開黏骨膜。剝離子剝離暴露骨面，于第一磨牙與中切牙中間處，用口腔科種植手機(800 r/min)配備直徑2 mm裂鉆垂直制備約4 mm×4 mm×4 mm骨缺損，邊磨邊生理鹽水沖洗，間斷磨除，磨至骨松質(zhì)后用口腔科小刮尺刮至牙根面，生理鹽水清洗創(chuàng)面，棉球壓迫止血。無明顯出血后，用1號線全層縫合切口。造模后在右側(cè)臀大肌處肌注青霉素，40萬U/次，2次/d，連續(xù)3 d。造模后飼養(yǎng)條件同術(shù)前。觀察并記錄造模后動物精神、飲食、兩便、活動及傷口愈合情況。分別于造模后1、4、8、12周各隨機選取5只動物經(jīng)耳緣靜脈注射過量戊巴比妥鈉將其處死，完整取出雙側(cè)下頜骨體部，去軟組織，觀察標本局部成骨情況。

1.3 牙槽骨缺損影像學檢查 將不同時間點取得的牙槽骨缺損標本置于口腔X射線機下拍片。拍攝條件：距離10 cm，電壓70 kV，電流7 mA，曝光時間0.051 s。觀察不同時間點骨缺損修復(fù)情況。用雙能X線骨密度儀測量骨缺損處骨密度，測得骨缺損修復(fù)區(qū)骨礦鹽含量、成骨質(zhì)量及成骨速度。選取包含骨缺損的6 mm×5 mm范圍作為測量區(qū)域。每標本測量3次，取平均值。

1.4 牙槽骨缺損組織學變化觀察 用口腔科高速手機在骨缺損近遠中各2 mm處鋸下標本，均分為兩份。一份于10%中性甲醛溶液中固定2 d，流動水沖洗2 h，常規(guī)脫鈣72 h，逐級脫水，石蠟包埋，按頰舌向縱切，連續(xù)切取厚度2 μm切片，選取組織塊中心部位切片2張，行蘇木精-伊紅染色，于FSX100顯微鏡下觀察新骨形成情況并采集圖片。

1.5 成骨細胞活性測定 取骨缺損標本定量后勻漿，加PBS緩沖液提取，3 000 r/min離心30 min，取上清液。嚴格按堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒說明書進行操作，用酶標儀于450 nm波長處測吸光度值，獲得每克標本中ALP活性作為成骨細胞活性。

2 結(jié)果

2.1 造模后不同時間點實驗動物一般情況比較 實驗動物造模后反應(yīng)良好，體溫不高，精神略差，飲食及活動減少，切口周圍軟組織略腫脹，3～5 d恢復(fù)正常，7 d切口甲級愈合，無感染、裂開、壞死，縫線隨飲食自行脫落。術(shù)區(qū)及周圍均未見急性炎癥反應(yīng)。造模后1周牙槽骨缺損切口表面黏膜略紅腫，刮除表面瘢痕組織后可見明顯凹陷骨洞區(qū)，缺損處被肉芽組織及血凝塊充填。造模后4周口內(nèi)黏膜顏色正常，縫線已自行脫落，縱切面觀骨缺損處填滿纖維組織及纖維骨痂，探有硬度，骨洞區(qū)變淺，有少許新生骨形成。造模后8周牙槽骨缺損骨洞進一步變淺，表面粗糙，但凹陷較明顯，縱切面觀察新生骨與與周圍骨界限不清。造模后12周骨缺損處與周圍骨組織界限不清，表面略粗糙，骨缺損處凹陷較明顯，顏色較周圍骨組織偏淺?？v切面觀察骨缺損處與周圍骨已無界限，但靠近缺損處中央，仍有少量纖維組織殘留。

2.2 造模后不同時間點牙槽骨缺損影像學檢查結(jié)果比較 造模后1周骨缺損處低密度影像明顯，邊界清晰。造模后4周骨缺損處邊緣見云霧狀改變，可見阻射的骨小梁影像，以缺損底端最為明顯。造模后8周骨缺損處邊界分辨不清，骨缺損處密度仍相對較低，低密度影像向中心縮小，骨缺損表面阻射度仍較低。造模后12周缺損處底端與周圍松質(zhì)骨無明顯區(qū)別，表面骨密度偏低。造模后1、4、8、12周牙槽骨缺損處及非手術(shù)區(qū)正常牙槽骨骨密度分別為(0.176±0.005)、(0.198±0.011)、(0.277±0.003)、(0.301±0.014)、(0.358±0.011)g/cm2。牙槽骨缺損骨密度值正常牙槽骨>造模后12周>造模后8周>造模后4周>造模后1周，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.3 造模后不同時間點牙槽骨缺損組織學變化比較 造模后1周骨缺損處內(nèi)部見較多炎性細胞，以急性粒細胞為主，有少許血凝塊尚未被吸收。造模后4周骨缺損處見有新生骨小梁生成，但較細，散亂排布，邊緣可見單層排列的成骨細胞，骨小梁內(nèi)骨細胞較為活躍，骨小梁之間有較多血管發(fā)生。造模后8周骨缺損處四周骨小梁粗大，較多已聯(lián)合，纖維組織逐漸減少并開始鈣化為類骨質(zhì)，新生骨與宿主界面不清，成骨細胞密度有所下降，但骨缺損中央處骨小梁較纖細，纖維組織較多。造模后12周骨缺損處骨小梁粗大致密，較多聯(lián)合成片狀，骨小梁邊緣成骨細胞較活躍，有豐富的血管網(wǎng)，負重區(qū)向成熟的板層骨改建，內(nèi)部為骨髓腔較大的松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，但相對周圍正常骨床仍顯雜亂，骨結(jié)構(gòu)層次性相對稍差。

2.4 造模后不同時間點牙槽骨缺損組織中成骨細胞活性比較 造模后1、4、8、12周牙槽骨缺損組織中ALP活性分別為(2.67±0.13)、(28.24±0.29)、(21.79±0.21)、(11.48±0.38)U/g。造模后第1周ALP活性最低，第4周活性最高，之后逐漸降低，12周時仍維持較高水平，各時間點比較差異有統(tǒng)計學意義(P均﹤0.05)。

3 討論

牙槽骨缺損的修復(fù)與再生一直是口腔醫(yī)學界亟待解決的問題之一。應(yīng)用于牙槽骨缺損修復(fù)的材料有羥基磷灰石、生物活性玻璃等諸多材料，組織工程技術(shù)是修復(fù)骨缺損較前沿的研究，然而動物實驗是每種材料應(yīng)用于臨床的必經(jīng)環(huán)節(jié)，為便于學者們多角度研究牙槽骨缺損行之有效的骨替代材料，動物模型是首要解決的問題。

在研究牙槽骨缺損移植材料的實驗動物選擇上，早期國外較多學者以大鼠為研究模型[1～3]，大鼠個體小，存在手術(shù)操作困難，即使手術(shù)造模成功，仍面臨骨移植物難以植入的缺點。在牙槽骨缺損重建的研究上，多數(shù)學者開始以羊或犬為模型開展研究[4～7]，或者以小型豬為實驗對象[8,9]。羊、犬、小型豬均屬大型動物，盡管能較好地復(fù)制人類牙槽骨缺損模型，但存在飼養(yǎng)成本高、管理難度大等問題。兔成為多數(shù)學者的首選，然而模型的制作方法各異。兔上頜骨腭弓弧度較大，黏骨膜較厚，且受張口度的限制，不宜制作骨缺損。在下頜骨的模型制備中，胡楊等[10]提出用拔除雙側(cè)下頜中切牙的方式制備缺損模型，但兔切牙牙根較長，牙根一直延續(xù)到頦孔位置，牙根尖端與牙頸部直徑相當，無明顯根尖，成年兔切牙冠根比約為1∶8，牙根牙本質(zhì)較薄，髓腔粗大，且牙根彎曲明顯，拔除較為困難。牙頸部周緣牙槽嵴較薄，拔除中較易出現(xiàn)牙槽嵴骨折，且較易牙根折斷，殘留斷根可能造成骨缺損的研究結(jié)果失真。前期研究中，參考吳哲等[11]在大鼠牙槽嵴吸收模型中的方法，用裂鉆將兔的切牙牙冠磨除1/2，在其尚未恢復(fù)咬合關(guān)系時，再次磨除1/2，先后磨除4次后，切牙出現(xiàn)松動，分離牙齦后能夠?qū)⑵浒纬?，但因反?fù)麻醉，動物數(shù)量較多，實驗周期過長，不適合作為牙槽骨缺損的模型推廣。在進行第一磨牙的拔除時，均遇到同樣困難。馬躍等[12]在比較倍骼生與羥基磷灰石在牙槽骨的修復(fù)效果時，采用縱行劈開下頜骨下緣的方法對比材料性能，此種方法需在口外切開，手術(shù)創(chuàng)傷大，操作難度高，造模后可能會影響動物進食。富建明等[13]在下頜骨體部磨牙區(qū)頰側(cè)制作1.5 cm×1.5 cm骨缺損模型來研究材料的修復(fù)效果，但兔頰側(cè)密質(zhì)骨約0.44 mm，松質(zhì)骨約1.34 mm，該厚度較難植入材料，植入材料后材料易流失，難以客觀評價材料的成骨效果。房殿吉等[14]通過在兔下頜支頰側(cè)中下制備直徑1 cm全層骨缺損，深度0.5～0.6 cm，此方法會磨除部分磨牙牙根，暴露的牙髓組織可能會影響實驗結(jié)果，且手術(shù)會影響動物進食。另有部分學者在下頜升支處制造骨缺損模型，下頜升支骨壁較薄，植入植骨材料穩(wěn)定性差，且下頜升支骨質(zhì)與牙槽骨骨質(zhì)在組織學上有區(qū)別，不能有效模仿牙槽骨缺損或牙周骨缺損。本課題組在下頜中切牙與第一磨牙之間的無牙區(qū)制作牙槽骨缺損模型，此位置手術(shù)不受開口度的限制，視野清楚，操作簡單，不損傷頦神經(jīng)，且基本不影響造模后動物的進食，能夠較好地為骨移植材料在牙槽骨上的應(yīng)用提供參考。

人類局部牙槽骨急性缺損后，血凝塊充滿缺損區(qū)，24 h機化，逐步被肉芽組織替代；3～4 d后肉芽組織向纖維組織轉(zhuǎn)化；2周后骨缺損處骨小梁增生，進入機化的血凝塊，缺損區(qū)底端最先有新骨新成；3個月后，新生骨基本長滿缺損區(qū)，同時靠近軟組織側(cè)，軟組織的增值導(dǎo)致凹形骨缺陷。本實驗中骨缺損造模后自然恢復(fù)過程與人類局部牙槽骨缺損后的自然恢復(fù)過程類似，能較好地模擬人類局部牙槽骨缺損的修復(fù)過程。本實驗中骨密度測量顯示隨時間推移，骨缺損處骨密度逐漸增高，12周時骨密度達最高但仍低于周圍正常骨骨密度。因骨缺損處頰舌側(cè)各有骨板阻擋，所以骨缺損處實際骨密度值要低于測量值，但各組動物均未排除此干擾因素，所以此干擾因素不影響各組的數(shù)據(jù)比較。堿性磷酸酶活性在第4周時達頂峰，說明成骨細胞在此階段最為活躍，12周時仍較高，表明骨缺損處組織仍在向成熟骨組織改建中。

在兔下頜第一磨牙與中切牙中間的無牙區(qū)制造約4 mm×4 mm×4 mm缺損，所建模型全部成活，通過對每個時間點的監(jiān)測，能夠客觀評價局部牙槽骨缺損后的自然修復(fù)過程。未來研究某種骨替代材料時，將其植入模型中，同樣能夠評價研究材料的性能；而且此種模型建立簡單、評價客觀。通過各項指標的檢測，得出牙槽骨缺損自然愈合狀況下的數(shù)據(jù)，為以后研究骨替代材料性能時提供參考；同時本實驗將各種檢測方法敘述清晰，可作為骨替代材料隨時間修復(fù)效果檢驗的參考。

綜上所述，本實驗提出的在下頜第一磨牙與中切牙之間的無牙區(qū)制備牙槽骨缺損模型的方法，有操作簡單、重復(fù)性強、便于材料植入、缺損底端為牙根面等諸多優(yōu)點，為骨移植材料在牙槽骨缺損修復(fù)效果的評價奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] Pietrokovski J, Massler M. Ridge remodeling after tooth extraction in rats[J]. J DentRes, 1967,46(1):222-231

[2] Hsieh YD, Devlin H, Roberts C. Early alveolar ridge osteogenesis is following tooth extraction in the rat[J]. Arch Oral Biol, 1994,39(5):425-428.

[3] Matin K, Nakamura H, Irie K, et al. Impact of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on residual ridge resorption after tooth extraction: an experimental study in the rat[J]. Int J Oral Maxillofac Implants, 2001,16(3):400-411.

[4] Rachmiel A, Aizenbud D, Peled M. Enhancement of bone formation by bone morphogenetic protein-2 alveolar distraction: an experimental study in sheep[J]. J Periodontol, 2004,75(11): 1524-1531.

[5] Rutledge J, Schieber MD, Chamberlain JM, et al. Simvastatin application to augment facial jaw bone in a dog model: pilot study[J]. J Periodontol, 2011,82(4):597-605.

[6] 麥昱穎，武輝煌，麥志松，等.磷酸鈣骨水泥與聚乳酸-羥基乙酸微球復(fù)合物用于拔牙位點骨質(zhì)保存的動物實驗[J].中華口腔醫(yī)學雜志,2014,49(3):180-183.

[7] 譚麗思,林曉萍,劉堯,等.組織工程骨促進犬牙槽骨再生的體內(nèi)研究[J].口腔醫(yī)學研究,2010,26(2):183-186.

[8] Ruehe B, Niehues S, Heberer S, et al. Miniature pigs as an animal model for implant research: bone regeneration in critical-size defects. [J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2009,108(5):699-706.

[9] Pieri F, Lucarelli E, Corinaldesi G, et al. Effect of mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma on the healing of standardized bone defects in the alveolar ridge: a comparative histomorphometric study in minipigs[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2009,67(2):265-272.

[10] 胡楊,馬瑩,何惠宇.兔下頜骨前牙區(qū)剩余牙槽嵴模型的建立[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(20):3653-3656.

[11] 吳哲,孫宏晨,車彥海,等.大鼠下頜切牙拔出后剩余牙槽嵴吸收模型的建立[J].實用口腔醫(yī)學雜志,2007,23(1):36-39.

[12] 馬躍,徐寧,辛寧寧,等.倍骼生與羥基磷灰石在牙槽骨修復(fù)中的效果比較[J].山東大學學報(醫(yī)學版),2002,40(4)：333-336.

[13] 富建明,劉丹妞,孫海燕,等.納米羥基磷灰石修復(fù)兔頜骨缺損的骨密度分析[J].中國美容整形外科雜志,2007,18(2):102-104.

[14] 房殿吉,郭延偉,李松,等.脂肪干細胞復(fù)合載杜仲醇提取物支架材料修復(fù)兔下頜骨缺損的實驗研究[J].華西口腔醫(yī)學雜志,2013,31(1):65-69.