黎玉涵，孫小麗，何少儀，胡桂英，洪小山，布俏雯，羅喜平

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省婦幼保健院，廣州510010)

miRNAs是一類普遍存在的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，由18～24個(gè)核苷酸組成，通過與靶mRNA 3'端非編碼區(qū)(3′UTR)完全或不完全結(jié)合來影響靶基因的表達(dá)，調(diào)控生物體的發(fā)育、增殖、分化、代謝和應(yīng)激反應(yīng)等生理過程[1]。在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，miRNAs通過影響功能蛋白的表達(dá)及信號(hào)傳導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)等，參與癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡過程，在不同類型惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2,3]。miR-181a是miR-181家族的一員，其成熟體含23個(gè)核苷酸，位于1號(hào)染色體。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-181a在各類惡性腫瘤中表達(dá),如非小細(xì)胞肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、T淋巴細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌等，且影響著惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在不同類型惡性腫瘤中起到癌基因或抑癌基因的作用[4～8]。盡管miR-181a與惡性腫瘤的研究較深入，但與宮頸癌的關(guān)系及調(diào)控作用的研究報(bào)道少見。本研究觀察了轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物、抑制物的宮頸癌細(xì)胞株Siha和Hela增殖、凋亡、遷移情況的變化?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑 宮頸癌細(xì)胞系SiHa及HeLa均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，由廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保存。Trizol(Invitrogen)，SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒 (TaKaRa)，riboFECT CP Transfection Kit細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒(廣州市銳博生物科技有限公司)，miR-181a mimics、miR-181a inhibitors及U6引物均由廣州市銳博生物科技有限公司提供; DMEM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)，OPTI-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)，Annexin-V細(xì)胞雙染凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物)，Transwell小室(Corning)。

1.2 細(xì)胞分組及miR-181a模擬物、抑制物轉(zhuǎn)染 Siha細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。分4個(gè)實(shí)驗(yàn)。①將體外培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞分為觀察1組、對(duì)照1組和空白1組。觀察1組轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物、對(duì)照組1組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列、空白組只加入試劑。②將體外培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞分為觀察2組、對(duì)照2組和空白2組。觀察2組轉(zhuǎn)染miR-181a抑制物、對(duì)照組2組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列、空白組只加入試劑。③和④所用細(xì)胞為HeLa細(xì)胞，其余操作分別和①、②相同。轉(zhuǎn)染試劑采用riboFECT CP Transfection Kit轉(zhuǎn)染試劑盒，按試劑盒說明書操作。

1.3 各組細(xì)胞miR-181a檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。按照Trizol試劑盒說明書提取癌組織和細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄條件為25 ℃ 30 mim、42 ℃ 30 mim、85 ℃ 10mim，逆轉(zhuǎn)錄試劑由吉瑪公司提供。cDNA 采用SYBR Seclect Master Mix系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-125b的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參。miR-125b正向引物5′- ACTGATAAATCCCTGAGACCCTAAC-3′，反向引物5′- TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCAC-3′，U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′ ，反向引物5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-ΔΔCT表示miR-181a相對(duì)表達(dá)量。

1.4 各組細(xì)胞增殖情況觀察 采用克隆形成實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染48 h后消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為500 /mL，接種于6 孔板，每孔2 mL。常規(guī)培養(yǎng)，間隔2～3 d更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)10～14 d觀察細(xì)胞集落的生長(zhǎng)情況，肉眼可見集落形成時(shí)終止培養(yǎng)。大于 50 個(gè)細(xì)胞的集落計(jì)為1個(gè)克隆。克隆形成率=形成克隆細(xì)胞數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)目×100%。重復(fù)3 次。

1.5 各組細(xì)胞凋亡率測(cè)算 轉(zhuǎn)染48 h后，洗滌、消化細(xì)胞，每組取1×106個(gè)細(xì)胞離心。用200 μL的Binding Buffer 重懸細(xì)胞3次，加入PI染液5 μL，F(xiàn)ITC Annexin-V染液10 μL，混勻，室溫下避光孵育15 min。再加入300 μL的Binding Buffer 緩沖液，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 各組細(xì)胞遷移情況觀察 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。 轉(zhuǎn)染12 h后，細(xì)胞撤血清饑餓12～24 h，消化細(xì)胞，離心，用含0.2%FBS的原細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL。在Transwell小室下層各加入500 μL含10%FBS的原細(xì)胞培養(yǎng)液，上室加入250 μL細(xì)胞懸液。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去小室膜上層細(xì)胞。待膜風(fēng)干后，用0.1%的結(jié)晶紫染色15 min，倒置小室，在顯微鏡下觀察膜上細(xì)胞數(shù)，200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物的SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移情況變化 觀察1組、對(duì)照1組、空白1組SiHa細(xì)胞miR-181a相對(duì)表達(dá)量分別為2.4±0.08、1.09±0.04、0.85±0.02，Transwell小室實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為40.60±2.84、58.40±3.56、63.20±2.53，克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成率分別為20.54%±3.40%、50.99%±1.78%、53.06%±4.91%，細(xì)胞凋亡率分別為47.86%±2.04%、36.74%±3.50%、32.15%±2.30%。觀察1組SiHa細(xì)胞miR-181a相對(duì)表達(dá)量、Transwell小室實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)、克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成率、細(xì)胞凋亡率與對(duì)照1組、空白1組相比，P均<0.05。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-181a抑制物的SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移情況變化 觀察2組、對(duì)照2組、空白2組SiHa細(xì)胞miR-181a相對(duì)表達(dá)量分別為0.09±0.00、0.93±0.02、0.89±0.01，Transwell小室實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為113.80±4.50、67.20±2.10、65.20±2.03，克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成率分別為69.23%±4.25%、52.71%±1.84%、51.67%±2.25%，細(xì)胞凋亡率分別為30.15%±2.51%、32.51%±2.10%、33.05%±2.14%。觀察2組SiHa細(xì)胞miR-181a相對(duì)表達(dá)量、Transwell小室實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)、克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成率、細(xì)胞凋亡率與對(duì)照2組、空白2組相比，P均<0.05。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物的HeLa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移情況變化 觀察1組、對(duì)照1組、空白1組HeLa細(xì)胞miR-181a相對(duì)表達(dá)量分別為2.31±0.08、0.91±0.02、0.99±0.06，Transwell小室實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為40.00±3.51、56.40±3.56、58.80±2.13，克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成率分別為36.65%±1.82%、54.77%±3.52%、58.29%±2.56%，細(xì)胞凋亡率分別為46.66%±2.80%、23.64%±3.09%、22.10%±4.07%。觀察1組HeLa細(xì)胞miR-181a相對(duì)表達(dá)量、Transwell小室實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)、克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成率、細(xì)胞凋亡率與對(duì)照1組、空白1組相比，P均<0.05。

2.4 轉(zhuǎn)染miR-181a抑制物的HeLa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移情況變化 觀察2組、對(duì)照2組、空白2組HeLa細(xì)胞miR-181a相對(duì)表達(dá)量分別為0.02±0.00、0.80±0.02、0.93±0.05，Transwell小室實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為77.60±3.54、57.20±6.20、56.40±2.23，克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成率分別為79.11%±2.70%、56.82%±1.98%、57.34%±2.12%，細(xì)胞凋亡率分別為17.67%±2.30%、20.70%±2.09%、21.30%±3.17%。觀察2組HeLa細(xì)胞miR-181a相對(duì)表達(dá)量、Transwell小室實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)、克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成率、細(xì)胞凋亡率與對(duì)照2組、空白2組相比，P均<0.05。

3 討論

據(jù)報(bào)道，miRNA約占人類基因總數(shù)的 3%，可能調(diào)控著人體約30%的蛋白質(zhì)編碼基因[9～12]。近年來有關(guān) miRNA在疾病發(fā)生中發(fā)揮的作用及診治應(yīng)用方面的研究較多。miR-181a是較晚被發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，但和惡性腫瘤的關(guān)系較為密切。Panda等[13，14]報(bào)道m(xù)iR-181a在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)。Zhang等[15]報(bào)道m(xù)iR-181a 能通過調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因 KLF6 促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著癌基因的作用。Gao等[4]發(fā)現(xiàn)miR-181a低表達(dá)與肺癌患者的 TNM 分期、不良預(yù)后關(guān)系密切。Shin 等[5]發(fā)現(xiàn) miR-181a在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)量低于正?？谇唤腔掀ぜ?xì)胞; 上調(diào)miR-181a后口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)及侵襲、轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制，說明上調(diào)miR-181a 能逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性行為。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物的宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞增殖和遷移能力下降，細(xì)胞凋亡水平上升。轉(zhuǎn)染miR-181a抑制物可以達(dá)到相反的效果。提示miR-181a在宮頸癌細(xì)胞株中起到類似抑癌基因的作用。與上述研究結(jié)果相符。這提示我們miR-181a可能作為抑癌基因參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，miR-181a也可能是宮頸癌診治的新靶點(diǎn)。

目前對(duì)miRNA 的研究重點(diǎn)已從序列的發(fā)現(xiàn)鑒定轉(zhuǎn)為對(duì)其功能的識(shí)別和鑒定。已經(jīng)確定的miR-181a 靶基因有ATM[17]、Bcl-2[18,19]、KRAS[5]和WIF-1[20]等。Luo等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a通過抑制GRP78的表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞 HeLa、C-33A、SiHa、HT-4的增殖并增強(qiáng)上述宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。但此研究并未深入探討相關(guān)調(diào)控機(jī)制。本課題組將繼續(xù)對(duì)miR-181a的目的基因及相互調(diào)控的信號(hào)通路展開進(jìn)一步研究。此機(jī)制有望為宮頸癌的靶向治療提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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