隋友華

植物毒素是由植物產(chǎn)生的能引起人和動物疾病的有毒物質(zhì)。植物毒素的產(chǎn)生主要緣于植物在系統(tǒng)發(fā)育過程中的自我保護(hù)和防御機(jī)制，即植物抵抗對生物或非生物脅迫反應(yīng)而產(chǎn)生的代謝物，對某些化學(xué)元素的富集機(jī)制，以及植物在數(shù)億年的遺傳分化中，在各種環(huán)境的影響和遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的雙重作用下形成的生物多樣化。植物毒素的概念是MULLER和BORGER于1940年在馬鈴薯晚疫病研究當(dāng)中首次提出的，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)馬鈴薯塊莖被一種不相容的晚疫病生理小種侵染以后，植株對后來相容性晚疫病生理小種的侵染表現(xiàn)出抗性，因此他們假設(shè)在馬鈴薯受到不相容性晚疫病生理小種侵染以后，誘導(dǎo)產(chǎn)生了某種物質(zhì)（植物毒素）會抑制病菌的侵染從而表現(xiàn)出對后來相容性晚疫病生理小種的侵染表現(xiàn)出抗性。有毒植物是自然界一類特殊的植物類群，有毒植物之所以在體內(nèi)產(chǎn)生具有一定毒性的化學(xué)成分，是由于植物在長期的進(jìn)化過程中，要經(jīng)歷較長時(shí)間嚴(yán)酷的環(huán)境脅迫，為了應(yīng)對這種不利條件，植物體除了形成植物適應(yīng)陸生生活所需完善的組織與結(jié)構(gòu)外，在生物化學(xué)方面也要出現(xiàn)一些適應(yīng)性變化，這一變化除了植物產(chǎn)生所必需的代謝產(chǎn)物如糖類、脂類、蛋白質(zhì)及核酸類之外，還應(yīng)產(chǎn)生一些所謂的有毒的“次生代謝”產(chǎn)物，以適應(yīng)生存環(huán)境的不斷變化。自有生物界以來，生物毒素就已經(jīng)存在，人類對生物毒素的研究和利用也已有久遠(yuǎn)歷史，其研究發(fā)展對于農(nóng)業(yè)、畜牧、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)、環(huán)境、災(zāi)害防治等多方面亦有重要意義。植物毒素的研究具有廣泛的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值，其未來發(fā)展應(yīng)給予關(guān)注。

現(xiàn)在已知的植物毒素有1000余種，從化學(xué)結(jié)構(gòu)上將其分為蛋白毒素和非蛋白毒素兩大類，前者為生物大分子，后者是分子量較小的有機(jī)化合物。主要包括五大類，即非蛋白質(zhì)氨基酸、生物堿、蛋白質(zhì)毒素、不含氮毒素和生氰糖苷類毒素。在植物當(dāng)中通過生物或非生物脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物毒素種類繁多，在禾本科、豆科、茄科和葡萄科植物中檢測到的植物毒素有幾種到達(dá)幾十種之多，且各個(gè)科之間的植物毒素種類大都不相同。迄今為止蕓薹屬中分離出來的植物毒素共有45種，其中大多數(shù)都是源自氨基酸（硫）色氨酸（aminoacid（s）tryptophan）的含硫生物堿。植物毒素含量受許多因素的影響，如種間差異、生長階段、植株部位、自然環(huán)境、農(nóng)藥化肥施用情況等，一種植物可以含有多種不同的植物毒素，不同科屬的植物也可以含有相同的植物毒素，有的植物全株有毒，有的僅某個(gè)或數(shù)個(gè)部位有毒，有的植物全部發(fā)育階段有毒，有的只在某些發(fā)育階段有毒。蕓薹屬中已知的通過病原微生物誘導(dǎo)生成的植物毒素有camalexin、4 hydroxyindole3-carbonyl nitrile （4-0HICN）、spirobrassinin、環(huán)蕓薹寧cyclobra ssinin、rutalexin、rapalexinA、蕓薹抗毒素brassilexin、brassinin和erucalexin。以上植物毒素成分僅在白菜型油菜（AA基因組，Brassinin和spirobrassinin）、芥菜（AABB基因組）和擬南芥（camalexin和4-OH ICN）中檢測得到。目前國內(nèi)外對十字花科中植物毒素的研究還很不足，相關(guān)報(bào)道主要集中在對模式植物擬南芥的研究。雖然蕓薹屬作物植物毒素有9種，但在擬南芥中的植物毒素一度被認(rèn)為只有camalexin，RAJNIAK等于2015年在擬南芥中發(fā)現(xiàn)一種新的植物毒素4 hydroxyindole3 carbonyl nitrile （4-OHICN）。

已經(jīng)報(bào)道出最新研究出的植物毒素camalexin對擬南芥植物的一些病原體發(fā)揮防御功能，在擬南芥根部的積累對根腫菌的侵染表現(xiàn)出明顯的抗性，并且抗根腫病基因可以促進(jìn)camelexin的合成抑制根腫菌的生長。植物在受到病原微生物侵襲時(shí)，自身會識別病原微生物從而通過激活A(yù)SA、ASB/PAT PAI/IGPS/TSA/TSB CYP450家族相關(guān)基因從分支酸（chorismate）經(jīng)一系列復(fù)雜反應(yīng)合成色氨酸（tryptophan）并最終形成多種植物毒素來抗擊來自病原微生物的威脅。國內(nèi)外對蕓薹屬中通過病原微生物誘導(dǎo)生成的植物毒素的代謝途徑及其調(diào)控基因大都還處于未知狀態(tài)。camalexin和4-0H-ICN這兩種植物毒素在擬南芥中的研究最為深入，它們的合成途徑共享了由色氨酸合成IAOx的途徑，IAOx之后受一對旁系同源基因（CYP71A12/CYP71A13）以及其他C YP家族基因調(diào)控最終分別生成camalexin和4-OHICN。camalexin的合成途徑除了部分主要調(diào)控基因仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證之外都已經(jīng)清晰明了；4-OH ICN的合成途徑及主要調(diào)控基因已基本清楚。在色氨酸到camalexin和4-OH-ICN的合成途徑當(dāng)中，在其他基因的調(diào)控下還可以經(jīng)IAOx或者IAN合成吲哚乙酸，也可經(jīng)由IAOx在CYP8381等基因的作用下合成吲哚類硫苷。由此可見植物次級代謝產(chǎn)物合成途徑的復(fù)雜性。

試驗(yàn)中高效液相色譜法（HPLC）用于植物毒素的提取，高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種色譜方法，與經(jīng)典的液相色譜法相比，高效液相色譜法具有下列主要優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用了顆粒極細(xì)（一般為10微米以下）、規(guī)則均勻的固定相，傳質(zhì)阻抗小，分離效率高；采用高壓輸液泵輸送流動相，分析時(shí)間短；廣泛使用了高靈敏檢測器，大大提高了檢測靈敏度。高效液相色譜法自20世紀(jì)60年代崛起，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，在理論和實(shí)踐方面日趨完善，已經(jīng)成為一種主流的色譜分析方法。使用高效液相色譜法時(shí)需要注意的問題：樣品的相對分子質(zhì)量大或復(fù)雜其保留行為對有機(jī)溶劑比例的微量變化非常敏感，等度洗脫時(shí)分離結(jié)果的重現(xiàn)性差，如多肽、蛋白質(zhì)和低聚物等生物大分子，梯度洗脫是最好的選擇；若樣品溶解于己烷、庚烷等非極性溶劑時(shí)，即為非極性樣品，可以考慮使用正相色譜；若樣品溶解于二氯甲烷、甲醇、乙腈等極性溶劑時(shí)，即為極性樣品，考慮的分離模式就是反相色譜；如果樣品溶于水，就首先檢查水溶液的pH值；當(dāng)樣品中有酸或堿性物質(zhì)時(shí)，較常用的是緩沖鹽，其不僅可以控制流動相的pH值，還起到提高保留時(shí)間的重現(xiàn)性和改善峰形的作用；當(dāng)樣品中有對映異構(gòu)體時(shí)，就要考慮在流動相中加入手性衍生化試劑或使用手性色譜柱；有機(jī)溶劑的種類和配比決定流動相的極性，即洗脫能力，這對出峰時(shí)間、峰形、分離度等有著不可忽視的作用；有機(jī)溶劑的種類和配比決定流動相的極性，即洗脫能力。這對出峰時(shí)間、峰形、分離度等有著不可忽視的作用。

蕓薹根腫菌（P.brassicae）專性寄生于蕓薹屬、蘿卜屬以及擬南芥等十字花科活體植物的根部，其分類地位尚不清楚，一般認(rèn)為根腫菌屬于原生動物界、絲足蟲門、植物寄生黏菌綱、根腫菌目、根腫菌科的一種有害菌，是栽培和野生十字花科感病植物上根腫病的致病性病原菌，病菌通過侵染蔬菜、油菜等十字花科植物根毛導(dǎo)致根部薄壁細(xì)胞增生而形成腫瘤，1878年由俄國學(xué)者WORONIN首次發(fā)現(xiàn)并命名。根腫?。–lubrootdisease）是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophorabrassicae）侵染引起的一種傳染性非常強(qiáng)的土壤病害。當(dāng)植物根系受到病菌刺激，薄壁細(xì)胞大量分裂和增大，植株根組織異常大量增生而形成腫瘤，隨著腫根不斷膨大，根部維管束組織受損，導(dǎo)管不通暢，不能有效地吸收和運(yùn)輸?shù)V物質(zhì)和水，導(dǎo)致生理機(jī)能受阻。侵染后期，植株地上部分死亡，根系上細(xì)胞受到病菌刺激大量分裂增生，腫瘤逐漸粗糙直至表面龜裂，常易受到其他雜菌入侵而造成腐爛，從而導(dǎo)致根系生長和吸收能力受損，病株地上部則表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩、葉片失綠變黃、無光澤、植株矮小、不能形成正常器官、萎蔫甚至枯萎死亡等癥狀，造成品質(zhì)下降，減產(chǎn)，給生產(chǎn)帶來巨大損失。腫瘤形成的部位、大小多與寄主有關(guān)，一般白菜、花椰菜、甘藍(lán)等葉菜類蔬菜的根瘤主要發(fā)生在主根及側(cè)根上，主根上根腫大但數(shù)量少，側(cè)根上根腫數(shù)量多但體積小。該病最早發(fā)現(xiàn)于地中海西岸和歐洲南部，在歐洲、北美發(fā)病已久，后傳入韓國、日?，F(xiàn)在全世界均有分布，尤以溫帶地區(qū)發(fā)生更為嚴(yán)重，目前，根腫病在中國大部分省、市、自治區(qū)都有分布，特別是進(jìn)入21世紀(jì)后，根腫病在云南、重慶、四川等地迅速擴(kuò)大。近年來，面對蕓薹種根腫病發(fā)病的嚴(yán)重趨勢，國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)在蕓薹種抗根腫病基因的挖掘和定位方面取得了很大進(jìn)展。日本研究者YOSHIKAWA（1993）通過對蕓薹種不同亞種包括結(jié)球白菜亞種、白菜亞種和蕪菁亞種的根腫病抗性鑒定，僅從源于歐洲的蕪菁中，發(fā)現(xiàn)了抗根腫病遺傳資源。此后，世界各地科研人員相繼利用這些抗源定位到了一些抗病基因。迄今，從這些抗病資源中共發(fā)現(xiàn)和定位了14個(gè)CR位點(diǎn)。

蕓薹屬作物是我國最為重要的蔬菜和油料作物之一，包括大白菜、甘藍(lán)、花椰菜、青梗菜、菜薹等大宗蔬菜，甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜等油料作物。常年種植面積3.75億畝，其中油菜面積1.02億畝，蔬菜2.73億畝。但近年來，我國大部分蕓薹屬作物產(chǎn)區(qū)受到根腫病的嚴(yán)重侵染，并有大面積擴(kuò)散的趨勢，尤以蕓薹種蔬菜作物大白菜受害最為嚴(yán)重。根腫病現(xiàn)已成為我國蕓薹屬作物的主要病害之一，在世界各地每年因根腫病的危害導(dǎo)致蕓薹屬作物減產(chǎn)多達(dá)10%～15%，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致作物絕收。

根腫病的防治形勢已刻不容緩，但現(xiàn)有的根腫病防治方法仍然有相當(dāng)?shù)木窒扌浴１热缟锓乐?、化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治措施雖然在一定程度上起到了防治根腫病的作用，但同時(shí)存在土壤、環(huán)境污染，生產(chǎn)成本高等諸多問題，仍不能從根本上解決大白菜栽培所面臨的嚴(yán)重問題。國際上對根腫病的研究，特別是對根腫菌生理小種鑒定一直都非常重視，因?yàn)殍b定結(jié)果直接關(guān)系到抗根腫病品種的有效選育。國內(nèi)對根腫病的研究基本上側(cè)重于發(fā)病規(guī)律和防治方面，對病原菌生理小種、發(fā)病機(jī)理、抗性育種等方面的報(bào)道還很少。雖然大白菜抗根腫病育種取得了一定的進(jìn)展，但也面臨著由根腫菌生理小種變化而引起的抗性喪失問題。抗根腫病基因的挖掘和抗病基因的克隆受限于抗源材料的缺乏，相關(guān)研究也進(jìn)展緩慢。從抗病基因的挖掘，利用分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）技術(shù)，到選育出復(fù)合抗病品種的育成才是防控根腫病危害最經(jīng)濟(jì)和有效的途徑之一。

camalexin對根腫菌侵染具有抗性作用并且抗根腫病基因能夠促進(jìn)camelexin的合成這一發(fā)現(xiàn)為蕓薹屬十字花科作物的抗根腫病研究開辟了一條新的途徑，為日后對其他抗根腫病植物毒素的研究打下基礎(chǔ)，從而進(jìn)一步深入研究植物毒素對根腫菌的防御機(jī)制、挖掘合成植物毒素的基因及植物毒素合成與抗病基因之間的關(guān)系等等，對解決世界蕓薹屬作物根腫病害問題具有重要意義。