李艷霞，劉忠玲，劉建明，李桂君

0 引言

組織培養(yǎng)具有培養(yǎng)周期短，繁殖系數(shù)高等優(yōu)點，是種質資源保存、育種以及遺傳轉化等研究的有效技術手段，已被廣泛應用于農、林業(yè)等領域［1-3］。影響植物組織培養(yǎng)成敗的主要因子有樹種、品種、外植體、培養(yǎng)基和植物生長調節(jié)劑等［4-7］。

樹莓（Rubus idaeus）為薔薇科懸鉤子屬樹種，其果實營養(yǎng)豐富，具有抗氧化、調節(jié)代謝、抗腫瘤、預防心腦血管疾病和增強免疫力等作用［8-9］，有較大的應用開發(fā)價值［10］。樹莓優(yōu)良品種被引入我國已有30多年的歷史，栽培面積較大，目前還是以根孽苗繁殖、栽培為主，導致品種退化、產量降低，病蟲害問題嚴重，國外樹莓品種栽植上主要采用組培苗，甚至很多國家都采用脫毒苗［11］。“波拉納”( Polana) 是夏、秋雙季結果型紅樹莓品種，果實較大，口味佳，耐寒，因每芽產生兩個結果側枝而高產［12］，在黑龍江省7月下旬開始采收秋果，適合秋季早霜期較早的地區(qū)種植。因此，本研究采用組織培養(yǎng)技術對“波拉納”進行繁殖研究，以期建立其離體培養(yǎng)再生組培體系，為今后工廠化育苗和種質資源保存等工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為葦河林業(yè)局青山種子園采摘園內露地栽培的“波拉納”2年根蘗苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒及基本培養(yǎng)基的篩選

取當年新生嫩枝剪成段，放入組培瓶中，滴2～3滴洗潔精，在自來水下沖洗1 h左右。在超凈工作臺上，用75%的乙醇溶液消毒，消毒時間設定為0、30、50 s，無菌水沖洗1次，轉到0.1%的升汞中滅菌，滅菌時間設定為2、4、8 min，再以2%次氯酸鈉滅菌，滅菌時間設定為2、4、8 min，無菌水沖洗4次，最后用無菌濾紙吸干表面水份，以WPM、1/2 MS、MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0.5 mg/L6BA和0.1 mg/LNAA，將消毒后的帶腋芽莖段剪成1～2 cm接種到培養(yǎng)基上，按照正交表L9(34)設計成 9 種不同的處理，每個處理接種40個莖段，重復 3 次。蔗糖 25 g/L，瓊脂 6.0 g/L，pH 值 5.8，培養(yǎng)溫度25±2 ℃，光周期14 h/d，光照強度2 200 lx，以下試驗條件均與此相同。接種一周后統(tǒng)計污染率、褐化率，接種后20 d調查成活率。

1.2.2 增殖培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，添加植物生長調節(jié)劑KT、NAA和6 BA，KT濃度設定為0、1.0、2.0 mg/L，NAA濃度設定為0.1、0.2、0.5 mg/L，6 BA濃度設定為0.1、0.5、1.0 mg/L。按照正交表 L9( 34) 設計成 9 種不同的處理。將誘導的芽單獨切離下來接種到培養(yǎng)基上，每個處理接種30個芽，分別接種在5個培養(yǎng)瓶中，每瓶接種6個芽，重復 3 次。30 d 后調查其增殖倍數(shù)和生長情況。

1.2.3 生根培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，添加IBA，濃度分別設定為0.1、0.5、1.0 mg/L，切取2.0 cm左右健壯一致的微枝轉接到生根培養(yǎng)基上誘導生根，共3個處理，每個處理接種50株，重復3次，25 d調查生根率、生根條數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

按下列方法統(tǒng)計污染率、成活率、增殖系數(shù)和生根率，采用SPSS21.0軟件進行方差分析及多重比較。

污染率=（外植體污染數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

褐化率=（外植體褐化數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

成活率=（外植體誘導成活數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

增殖系數(shù)=增殖的苗數(shù)/接種苗數(shù)。

生根率=（生根苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%。

2 結果與分析

2.1 消毒劑、培養(yǎng)基對外植體誘導的影響

不同消毒方式對外植體滅菌效果有較大影響，選擇適宜的消毒劑及濃度直接影響著能否獲得大量無菌材料。由表1可見，不同處理間污染率、褐化率和成活率均存在顯著、極顯著差異。處理1污染率達到100%，成活率為0；處理3和9雖然無污染，但是大部分材料褐化、甚至死亡，誘導成活率較低，分別為19.63%和39.15%；處理2、4、8污染率較高，處理5和7褐化率較高；而處理6即用75%乙醇處理30 s、0.1%升汞處理8 min、2%次氯酸鈉處理2 min效果最好，污染率為2.88%，褐化率為15.93%，成活率為81.11%。

培養(yǎng)基能提供植物組織生長所必需的養(yǎng)料，選擇適宜的培養(yǎng)基是關系組培體系成功的關鍵因素之一。消毒處理后的莖段接種到1/2 MS、MS、WPM培養(yǎng)基上，滅菌徹底、未褐化的腋芽培養(yǎng)一周開始萌動，10 d左右葉片開始展開、節(jié)間伸長。在MS培養(yǎng)基上，腋芽生長較快，芽生長健壯、嫩綠，在1/2 MS培養(yǎng)基上生長一般，在WPM培養(yǎng)基上生長最慢，因此本研究確定MS為樹莓“波拉納”組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。

表1 消毒劑、培養(yǎng)基類型對樹莓“Polana” 腋芽萌發(fā)的影響Tab.1 Effect of different disinfectants and culture medium on germination of axillary buds from stem of Raspberry “Polana”

2.2 生長調節(jié)劑對芽增殖的影響

將誘導的幼苗接種到不同植物生長調節(jié)劑濃度的MS培養(yǎng)基上，正交試驗結果見表2，各處理間增殖系數(shù)、苗高均存在極顯著差異。當使用NAA與6-BA植物生長調節(jié)劑組合時，切口處逐漸產生褐化的愈傷組織，培養(yǎng)一段時間后植株的葉片逐漸變黃，幼苗生長越來越差，最終死亡。在培養(yǎng)基中添加KT與NAA、6-BA配合使用，10 d后基本逐漸膨大，30 d能夠誘導出嫩綠的叢生芽，說明KT對“波拉納”叢生芽的誘導有重要作用。當使用1.0 mg/LKT與NAA、6-BA組合時，叢生芽的分化能力較強，當使用2.0 mg/LKT與NAA與6-BA組合時，叢生芽分化數(shù)量有所減少。9個處理中增殖系數(shù)最高的是處理4，與處理7、8、9達到極顯著差異，苗高最高的是處理4，與處理5、9達到極顯著差異。從增殖系數(shù)和苗高進行綜合評價選出，叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基及植物生長調節(jié)劑組合為: MS + KT1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+ 6-BA0.5 mg/L，增殖系數(shù)為5.14，苗高為2.89 cm。

表2 不同生長調節(jié)劑及濃度對樹莓 “Polana” 叢生芽增殖的影響Tab.2 Effect of different types and concentration of plant regulator on regeneration of multiple shoots of Raspberry “Polana”

2.3 生根培養(yǎng)

切取2 cm高，且生長一致健壯的微枝，分別接種到添加不同濃度IBA的MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，不同處理間生根率、生根條數(shù)達到極顯著、顯著差異（表3），當IBA濃度為0.1 mg/L時，生根時間較晚，15 d左右生根，25 d時生根率較低，為86.15%，生根條數(shù)為5.25條；當IBA濃度為0.5 mg/L時，一周后開始生根，25 d生根率達到100%，生根條數(shù)達到6.14條，主根粗壯。當IBA濃度為1.0 mg/L時，試管苗也是一周左右開始生根，生根率均達到100%，生根率與生根條數(shù)與IBA濃度為0.5 mg/L時差異不顯著，但是主根細長。

表3 IBA濃度對樹莓“Polana”生根的影響Tab.3 Effect of different IBA concentrations on rooting of Raspberry“Polana”

3 結論與討論

對外植體進行滅菌處理是建立組織培養(yǎng)體系的第一個環(huán)節(jié)，消毒劑和消毒時間決定著滅菌效果的好壞。消毒處理時間太短則滅菌效果差，外植體會因染菌而逐漸死亡；消毒處理時間太長，消毒劑會導致外植體褐化，甚至直接死亡。針對樹莓品種“波拉納”，本試驗篩選出最佳消毒處理方案為：75%乙醇處理30 s+0.1%升汞處理8 min+2%次氯酸鈉處理2 min效果最好。

以往有關樹莓組織培養(yǎng)試驗中，主要研究了不同品種、不同外植體、培養(yǎng)基及生長調節(jié)劑對叢生芽的誘導和生根的影響［13-17］。植物生長調節(jié)劑是組織培養(yǎng)的關鍵因子之一，且不同植物生長調節(jié)劑及濃度對樹莓離體材料的誘導及叢生芽分化有顯著差異［18］。NAA、6-BA、ZT、KT和 TDZ是誘導樹莓外植體分化中常用的植物生長調節(jié)物質，而適宜濃度的生長素和細胞分裂素的添加對于不同外植體的分化起決定性作用。張宗勤等（2004）［19］研究表明，在“圖拉明”（Tulameen）叢生芽誘導過程中，添加0.1 mg/LTDZ與1.0 mg/L BA配合可獲得最佳的繁殖效果，但TDZ與IAA配合對“圖拉明”生根并沒有促進作用。李海燕等（2011）研究表明，6-BA有利于樹莓品種“金克維”（Kivigold）叢生芽的繼代增殖，但6-BA的濃度應該低于1.5 mg/L［20］。本研究以MS培養(yǎng)基附加不同濃度的KT、NAA和6-BA進行“波拉納”叢生芽的誘導試驗，結果表明KT在叢生芽誘導過程中起關鍵作用，在不含KT的培養(yǎng)基上，幼苗不分化，長勢差逐漸褐化死亡。當使用1.0 mg/LKT時，叢生芽分化能力明顯比使用2.0 mg/LKT與NAA與6-BA組合時強，這說明高濃度KT對叢生芽誘導有抑制作用。叢生芽最佳增殖的培養(yǎng)基及植物生長調節(jié)劑組合為:MS + KT1.0 mg/·L+ NAA 0.1 mg/L+6-BA0.5 mg/L。

在植物組織培養(yǎng)過程中，IBA被廣泛用于試管苗的生根研究。在“波拉納”的生根實驗中，IBA濃度對生根影響較大，在0.1～1.0 mg/L范圍內，隨著IBA濃度升高，生根率也隨之升高，但并不是隨著IBA濃度越大，生根情況越好，IBA濃度為1.0 mg/L時，根細長，狀態(tài)不好。因此，最適宜“波拉納”生根的培養(yǎng)基及植物生長調節(jié)劑濃度為MS+IBA0.5 mg/L。

［1］畢海林, 楊正松, 楊洪濤, 等. 秋福樹莓組織培養(yǎng)和快速繁殖技術研究［J］.江西農業(yè)學報, 2013, 25( 3): 36 -38.

［2］王淼淼, 馬曉月, 張學英, 等.蘋果抗寒矮化砧木71-3-150莖尖培養(yǎng)快繁體系建立［J］. 西部林業(yè)科學, 2014, 43 (6):44-47.

［3］甘 專, 劉 偉, 馬孟增, 等. 毛葡萄莖尖的離體培養(yǎng)與植株再生［J］. 西南農業(yè)學報, 2013, 26(3):1164- 1168.

［4］浦艷吉, 李國懷, 姚延興, 等.李莖尖離體培養(yǎng)與植株再生［J］.華中農業(yè)大學學報, 2009, 28 (2)：214- 217.

［5］Eldeen S A S, Sdeed W T, Hassahlla I A. Micropropagation of peach rootstocks［J］. Bulletin of Faculty of Agriculture,University of Cairo, 1998, 49(4): 549-562.

［6］Hammatt N. Promotric by phloroglucinol of adventitious root formation in micropropagated shoots of adult wild cherry (Prunus avium L.)［J］. Plant Growth Regulation, 1994, 14(2): 127-132.

［7］Wei S, Timon B. Preliminary study on the methods of getting virus-free peach plantlets in vitro［J］. Acta Horticulturac, 1996,374(26): 191-194 .

［8］韓加, 劉繼文. 樹莓營養(yǎng)保健功效及開發(fā)前景［J］.中國食物與營養(yǎng), 2008, 3(8): 54-56.

［9］張清華, 董鳳祥. 樹莓發(fā)展現(xiàn)狀與前景［J］. 林業(yè)實用技術,2007(11)：9-11.

［10］張清華, 董鳳祥. 樹莓發(fā)展現(xiàn)狀與前景［J］. 林業(yè)實用技術,2007(12)：12 － 14.

［11］李艷霞, 鄧繼峰.樹莓在我國的引種栽培、繁殖研究［J］.中國林副特產, 2017, 146(1)：56-59.

［12］王彥輝, 張清華. 樹莓優(yōu)良品種與栽培技術［M］. 北京：金盾出版社, 2006.

［13］李媛媛, 郭修武 , 代漢萍, 等. 秋福紅樹莓葉片離體再生植株研究［J］.果樹學報, 2008, 25(6): 868-871.

［14］郭玉霞, 董彥琪, 劉喜存, 等. 紅樹莓組培快繁技術研究［J］.河南農業(yè)科學, 2011, (40)4：127-128.

［15］孫廷, 胡如善, 楊玉珍, 等.無刺樹莓的離體培養(yǎng)和快速繁殖技術［J］.安徽農業(yè)科學, 2003, 31(3):384-385.

［16］羅玉亮,李艷霞.雜種落葉松及親本建筑材優(yōu)良家系選擇研究［J］.林業(yè)科技, 2017, 42(2) : 14-17.

［17］朱玲.樹莓組培苗瓶外生根技術的研究［J］.林業(yè)科技,2014, 39(3) : 8-10.

［18］楊艷敏, 袁興福, 魏永祥, 等.樹莓組培快繁及工廠化育苗技術研究［J］.園藝與種苗, 2012(1)：32-35.

［19］張宗勤, 董麗芬, 張 波, 等. TDZ對樹莓微繁殖的影響［J］.經(jīng)濟林研究, 2004, (22)4：50-52.

［20］李海燕, 王小敏, 李維林, 等.樹莓品種“Kivigold”組培快繁技術體系建立［J］.中國農學通報, 2011, 27(4)：203-207.