李勝杰，周春龍，白俊杰,，吳建開，樊佳佳，費志平，孫建國，馬冬梅

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室， 廣州 510380；2.南京帥豐飼料有限公司，南京 211306；3.湖州湖旺水產(chǎn)種業(yè)有限公司，浙江湖州 313000；4.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070)

組織蛋白酶(Cathepsin)屬于木瓜蛋白酶超家族半胱氨酸蛋白酶，具有蛋白質(zhì)的加工、修飾和調(diào)控應(yīng)答等生物學(xué)功能。Cathepsin B(CTSB)是最早被關(guān)注的組織蛋白酶[1]，該酶可降解肌球蛋白，且對肌動蛋白的降解能力要小于肌球蛋白?；ǜ辊?Scomberaustralasicus)CTSB對肌原纖維蛋白產(chǎn)生明顯降解作用[2]。CTSB基因參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生[2-3]。CTSB基因在豬(Susscrofa)前體脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用，提高CTSB的表達，能促進豬前體脂肪細(xì)胞分化[4]。CTSB基因的突變對肉質(zhì)和生長性狀產(chǎn)生影響作用，如豬CTSB基因多態(tài)性與背膘厚顯著和日增重存在相關(guān)[5]，牛(BosTaurus)CTSB基因內(nèi)含子中的SNP位點與其體重和牛肉大理石紋性狀密切相關(guān)[6]。目前對于魚類CTSB的功能研究方面，鰱[7-8](Hypophthalmichthysmolitrix)、藍圓鲹(Decapterusmaruadsi)[9]和松江鱸[10](Trachidermusfasciatus)等魚類的CTSB基因序列已被克隆分離得到，且其活性得到證實，但關(guān)于魚類CTSB基因多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性研究還未見報道。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)原產(chǎn)于美國和加拿大，1983年被引進到我國大陸進行養(yǎng)殖，現(xiàn)已成為國內(nèi)的名優(yōu)淡水經(jīng)濟養(yǎng)殖品種之一[11-12]。鑒于CTSB基因是影響生長性狀的重要候選基因[13]，本研究從大口黑鱸CTSB基因中篩選SNP位點，并分析SNP位點與生長性狀的相關(guān)性，為大口黑鱸分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗用的20尾大口黑鱸采自珠江水產(chǎn)研究所廣州水產(chǎn)良種基地，剪取每尾魚尾鰭，在-20 ℃條件下無水乙醇中保存，用于后續(xù)SNP位點的篩選。用于生長關(guān)聯(lián)分析的大口黑鱸采自佛山市南海區(qū)九江鎮(zhèn)金匯農(nóng)場。選擇500尾親魚群體繁殖，將同一天收集的約100萬受精卵孵化出的魚苗轉(zhuǎn)入池塘中進行培育，將培育的大規(guī)格魚種放入面積為5 336 m2的池塘中喂養(yǎng)至成魚，8月齡時，從養(yǎng)殖群體中隨機挑選165尾，測量每尾魚的體質(zhì)量、全長、體長、體高、尾柄長和尾柄高等性狀值，并剪取尾鰭于-20 ℃條件下無水乙醇中保存。

1.2 SNP位點篩查

采用組織DNA提取試劑盒(廣州欣研生物科技有限公司)提取鰭條DNA。根據(jù)文獻[14]中CTSB基因(GenBank：KJ160497)序列設(shè)計擴增引物，正反向引物序列分別為 5′-ACACTAAAAGCTCCCTCCACT-3′和5′- GCCAAGGTTAGCGTAGAGAT-3′，引物由廣州吉格生物科技有限公司合成。PCR擴增程序的參數(shù)設(shè)置為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s， 72 ℃ 90 s，共32個循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴增產(chǎn)物于4 ℃條件下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測符合預(yù)期條帶后由上海博尚生物技術(shù)有限公司進行序列測定，采用Vector NTI軟件比對分析序列并篩選SNP標(biāo)記。

1.3 SNP位點的基因型分析

將提取的鰭條組織DNA和已獲得的SNP位點相關(guān)信息送往上海捷瑞生物工程有限公司進行SnaPshot分型，具體流程如下：根據(jù)目標(biāo) SNPs 側(cè)翼序列設(shè)計擴增引物(P1：5′-TGAGTCATATGAAAGCATTAC-3′和P2：5′-ACACTTTGTGTATGCAGGCTG-3′)，然后對每個樣品的DNA進行PCR擴增。PCR擴增后取3 μL PCR產(chǎn)物用ExoI和FastAP純化，主要是用ExoI去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物，用FastAP去除反應(yīng)中剩余的DNTP，37 ℃條件下15 min，80 ℃高溫滅活ExoI和FastAP酶15 min。根據(jù)ABI公司提供的SnaPshot試劑盒，用延伸引物進行延伸反應(yīng)，使用ABI公司的PRISM 3730測序儀進行基因分型。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

遺傳參數(shù)用POPGENE32軟件計算。采用SPSS17軟件中一般線性模型分析SNP位點與生長性狀的相關(guān)性，統(tǒng)計分析模型采用Yij=μ+Gi+eij，Yij為某個性狀第i個標(biāo)記第j個個體表型值；μ為統(tǒng)計分析中所有個體的平均表型值；Gi為SNP標(biāo)記的效應(yīng)值；eij為對應(yīng)于表型值的隨機殘差效應(yīng)值[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大口黑鱸CTSB基因序列和SNP位點篩查

PCR擴增后獲得的目的片段約為1 390 bp，經(jīng)測序和比對確認(rèn)擴增片段為大口黑鱸CTSB基因序列。該基因包含3個內(nèi)含子和4個外顯子，編碼區(qū)序列由990個堿基組成，共編碼330個氨基酸。將20個樣品的序列進行比對分析，在外顯子3上篩選到一個G/C突變位點，依據(jù)其所在序列中的位置和堿基類型命名為C+598G。

將大口黑鱸CTSB基因編碼區(qū)序列與GeneBank中已登錄的魚類CTSB基因進行比較，與條石鯛(Oplegnathusfasciatus，HM060314.1)的同源性最高，其核苷酸同源性為91%，與金頭鯛(Sparusaurata，KJ524457.1)、許氏平鲉(Sebastesschlegelii，AB490961.1)、點帶石斑魚(Epinepheluscoioides，KC832926.1)、伯氏樸麗魚(Haplochromisburtoni，XM_005915065.1)、牙鲆(Paralichthysolivaceus，AY686604.1)、青鳉(Oryziaslatipes，XM_020699636.1)、秀美花鳉(PoeciliaFormosa，XM_007549749.2)和彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris，XM_020938756.1)的核苷酸同源性分別為89%、88%、87%、86%、84%、84%和81%。C+598G突變位點除大口黑鱸具有G和C兩種堿基外，其他魚類在該位點的堿基均為G(圖1)，該堿基的突變使原來編碼甘氨酸的GGT突變?yōu)榫彼岬拿艽a子CGT，甘氨酸屬中性氨基酸，而精氨酸屬于堿性氨基酸。

圖1 不同魚類中C+598G突變位點附近序列的比對(C+598G位點處所比對的堿基采用方框標(biāo)記)Fig.1 The sequence alignment among different fishes for sequence nearby C+598G mutation site(the basic group compared in C+598 site was labeled by oblong box )

2.2 SNP位點在群體中的遺傳結(jié)構(gòu)分析

采用SnaPshot分型方法分析C+598G位點在165尾大口黑鱸個體中的基因型，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，C等位基因的頻率為64.24%，G等位基因的頻率為35.76%，3種基因型GG、GC、CC的頻率分別為40.6%、47.3%和12.1%。該位點的觀測雜合度度(Ho)、期望雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)分別為0.473、0.461和1.85。經(jīng)哈代-溫伯格平衡卡方檢驗，該位點符合哈代-溫伯格平衡定律(P>0.05)。C+598G位點的多態(tài)信息含量(PIC)為0.354，當(dāng)PIC值介于0.25～0.5時被認(rèn)為屬于中度多態(tài)性[16-17]。

2.3 C+598G位點與生長性狀關(guān)聯(lián)分析

C+598G位點3種基因型與生長性狀的相關(guān)性分析結(jié)果見表1，3種基因型個體在體質(zhì)量、全長、體長、體高、尾柄長和尾柄高等6個性狀上的平均值大小關(guān)系分別為：CC型>CG型>GG型，其中CC型與GG型在體質(zhì)量上存在顯著差異(P<0.05)，CC型個體的平均體質(zhì)量比GG型個體增重66.68g，提高了15.31%。

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，同一列不同上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

組織蛋白酶B是動物體內(nèi)重要的內(nèi)源蛋白酶，屬于木瓜蛋白酶超家族的半胱氨酸蛋白酶[18]。CTSB基因?qū)υS多生理過程均具有調(diào)節(jié)作用。本研究將大口黑鱸CTSB基因的編碼區(qū)序列與條石鯛等多種魚類的CTSB 基因編碼區(qū)序列進行比對，發(fā)現(xiàn)大口黑鱸CTSB基因核苷酸序列與這些魚類序列之間的同源性在81%到91%之間，具有較高的同源性，說明CTSB這類木瓜蛋白酶家族在魚類的進化上也與其他物種一樣具有很高的保守性，受到高度的進化限制，發(fā)揮重要的生理生化功能。

Russo等[5]在豬CTSB基因內(nèi)含子上篩選到3個SNP位點，鄧桂馨等[6]在黃牛CTSB基因內(nèi)含子6中篩選到1個SNP位點，而本研究首次在大口黑鱸CTSB基因外顯子上篩選到1個SNP位點，對該位點在165尾大口黑鱸養(yǎng)殖樣本中的基因型進行統(tǒng)計分析，CC、GC和GG型個體數(shù)分別為67、78 和20尾，其中GC雜合子占到47.3%，這可能與群體本身具有較豐富的遺傳多樣性有關(guān)。等位基因頻率分析結(jié)果表明，C等位基因頻率為64.2%，屬于有利基因，且CC型對生長性狀呈正相關(guān)，在生產(chǎn)應(yīng)用中，通過人工定向選擇基因型為CC純合子的親本，培育純合子品系，從而實現(xiàn)優(yōu)勢基因型的快速富集。

已有研究表明，豬和牛CTSB基因存在SNP位點，且SNP位點與背膘厚、日增重和凈肉重顯著相關(guān)[5-6]。本研究結(jié)果表明，CTSB基因C+598G位點的CC型個體在體質(zhì)量、全長、體高等多個生長性狀上明顯優(yōu)于 GG型個體，其中CC型與GG型在體質(zhì)量上存在顯著差異，表明CTSB基因的多態(tài)性對大口黑鱸生長性狀也產(chǎn)生影響作用。我們推測這是由于基因的單核苷酸突變，使原來編碼的甘氨酸突變?yōu)榫彼幔拾彼崤c精氨酸的物理性質(zhì)有所不同，前者是中性氨基酸而精氨酸為堿性氨基酸，這種變化可能導(dǎo)致其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，進而影響了蛋白的功能。這種由于一個編碼堿基的突變改變了氨基酸的種類而使性狀發(fā)生了明顯改變，可作為高效的分子標(biāo)記應(yīng)用于分子育種，如皮爾蒙特牛和比利時藍牛肌肉生長抑素(myostatin)基因的G/A轉(zhuǎn)換，引起氨基酸由半胱氨酸轉(zhuǎn)換為酪氨酸，該突變使牛表現(xiàn)出雙肌性狀并使產(chǎn)肉量提高[19]。

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