張敬霞，曲 芬

侵襲性真菌感染是重癥監(jiān)護(hù)和器官移植患者死亡的高風(fēng)險(xiǎn)因素[1]，其早期診治對(duì)提高救治率至關(guān)重要。其中，絲狀真菌是侵襲性真菌感染的主要病原菌之一，但絲狀真菌生長(zhǎng)緩慢（一般需要5～7 d）限制了早期診斷[2-3]，絲狀真菌的早期鑒定與耐藥性增強(qiáng)已成為臨床救治的重大難題[4]。目前，絲狀真菌常用的鑒定方法為鏡檢和菌落形態(tài)聯(lián)合鑒定，但不足之處是易受檢驗(yàn)人員主觀判斷影響。分子生物學(xué)方法雖是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其操作繁瑣且對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和操作人員的技術(shù)水平要求較高，不適合常規(guī)開(kāi)展[2]?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser-desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）技術(shù)可以通過(guò)檢測(cè)真菌中固有的特異性蛋白形成的特征性圖譜從而實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌菌種快速、準(zhǔn)確的鑒定[5-7]，對(duì)于指導(dǎo)臨床抗生素使用非常重要[3]。本文從技術(shù)原理、標(biāo)本前處理、鑒定效果及影響因素等方面對(duì)MALDITOF MS技術(shù)鑒定絲狀真菌的研究進(jìn)展作一綜述。

1 MALDI-TOF MS技術(shù)的鑒定原理

MALDI-TOF MS技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的，用于臨床分離病原菌全細(xì)胞鑒定的軟電離技術(shù)，其主要是針對(duì)菌種特異性核糖體蛋白進(jìn)行檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。MALDI-TOF MS主要由MALDI和TOF兩部分組成。MALDI技術(shù)的工作原理：激光照射樣品蛋白與過(guò)飽和的基質(zhì)溶液形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量并與樣品蛋白解吸附使樣品電離，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，從而使生物分子電離。TOF的工作原理：不同質(zhì)荷比（m/z）的離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間不同，獲得細(xì)菌特異的質(zhì)譜指紋峰圖。將該峰圖與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)圖譜進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)匹配結(jié)果進(jìn)行判讀。分值越高，匹配效果越好，準(zhǔn)確度越高。鑒定結(jié)果的評(píng)分范圍0～3.0，數(shù)值＞2.0表明鑒定結(jié)果可達(dá)到菌種水平，1.7～2.0表明鑒定結(jié)果僅達(dá)到菌屬水平，＜1.7為未達(dá)到菌屬水平，結(jié)果不可信。由于微生物菌種或菌屬存在不同程度的種內(nèi)差異，如核苷酸順序、生化反應(yīng)、指紋圖譜類(lèi)型等，因此，數(shù)據(jù)庫(kù)指紋圖譜應(yīng)該足夠全面以確保覆蓋菌種內(nèi)的天然差異。

2 MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定絲狀真菌的前處理

絲狀真菌的鑒定準(zhǔn)確性較差，且由于細(xì)胞壁厚和形態(tài)特征變化大，診斷方法一直難以突破[2]。MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定絲狀真菌基本步驟包括點(diǎn)靶、前處理、上機(jī)，其中難度最大的是絲狀真菌的前處理，即破壁。前處理也是影響絲狀真菌鑒定效果的主要因素。絲狀真菌細(xì)胞壁厚，為100～200 nm，且細(xì)胞壁的韌性和穩(wěn)定性都較強(qiáng)，普通的前處理方式難以奏效。Vermeulen等[8]分析了MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定完整絲狀真菌細(xì)胞和裂解后細(xì)胞的效果，結(jié)果顯示，細(xì)胞裂解法明顯優(yōu)于完整細(xì)胞法。

De Carolis等[9]通過(guò)對(duì)103株絲狀真菌（曲霉菌、鐮刀菌、毛霉目菌）運(yùn)用真菌孢子和水混合直接點(diǎn)靶的完整細(xì)胞法處理，使用MALDI-TOF MS技術(shù)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)94株已知菌中，91株能鑒定到菌種水平。同樣，Nenoff等[10]使用完整細(xì)胞法對(duì)285株皮膚真菌（紅色毛癬菌、毛孢子菌等）的研究顯示，78.2%的絲狀真菌可以鑒定到菌種水平。

細(xì)胞裂解法目前主要包括磁珠破碎法、海沙/丙酮-乙醇/甲酸乙腈提取法和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法等。磁珠破碎法的優(yōu)點(diǎn)在于可以對(duì)絲狀真菌充分研磨從而達(dá)到破壁效果，缺點(diǎn)在于操作比較繁瑣。2008年Hettick 等[11]運(yùn)用磁珠破碎法對(duì)12株青霉菌樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該方法對(duì)青霉菌鑒定的準(zhǔn)確率達(dá)到100%。此外，12株曲霉菌屬和5株不同的黃曲霉菌的鑒定結(jié)果表明其可以達(dá)到菌種水平的準(zhǔn)確鑒定[12]。該方法具有很高的重復(fù)性，Lau等[13]采用磁珠破碎法對(duì)421株固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的絲狀真菌鑒定，結(jié)果顯示，菌種和菌屬的鑒定準(zhǔn)確性分別達(dá)到370（88.9%）株和388（93.2%）株。

另外一種破壁的方式是甲酸乙腈前處理，也是臨床實(shí)驗(yàn)室最常用的方法。 Schr?dl等[14]對(duì)41株不同的橫梗霉進(jìn)行甲酸乙腈提取法處理，實(shí)現(xiàn)了在菌種水平100%的準(zhǔn)確鑒定率。Bille等[15]在甲酸乙腈提取法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了簡(jiǎn)化，將64株曲霉菌的孢子或菌絲與靶板上甲酸乙腈（1 μl 70%）預(yù)混后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，使用該裂解方法檢測(cè)準(zhǔn)確率可以達(dá)到86%，與Iriart 等[16]應(yīng)用甲酸乙腈提取法鑒定44株曲霉菌的效果（81.1%）相當(dāng)，甲酸乙腈提取方法同樣適用于絲孢菌屬、鐮刀菌屬、橫梗霉菌屬和皮膚癬菌的鑒定[8，17]。

最后一種方式是旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法，該方法可以得到均一的菌絲體，有利于絲狀真菌細(xì)胞壁的破壞。黃艷飛等[18]運(yùn)用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法對(duì)380株絲狀真菌培養(yǎng)鑒定，其鑒定菌屬和菌種的準(zhǔn)確率分別為94.0%和76.0%。因此，實(shí)驗(yàn)室在鑒定絲狀真菌時(shí)可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室條件和實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的前處理方法，從而達(dá)到滿意的鑒定結(jié)果。

3 MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定絲狀真菌的效果

近年來(lái)，MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)絲狀真菌快速鑒定的研究逐漸增加，鑒定的絲狀真菌種類(lèi)也在增多。Ranque等[19]選取了58種共625株絲狀真菌（毛癬菌、鐮刀菌、木霉菌和毛霉目菌等），應(yīng)用傳統(tǒng)方法和MALDI-TOF MS技術(shù)同時(shí)鑒定，菌種水平鑒定準(zhǔn)確率分別為80%和89%。對(duì)于非曲霉類(lèi)的絲狀真菌，MALDI-TOF MS技術(shù)的鑒定準(zhǔn)確率較傳統(tǒng)方法提高了31%～61%。MALDITOF MS技術(shù)對(duì)以下絲狀真菌鑒定效果較好，包括曲霉菌、青霉菌、毛癬菌、鐮刀菌、木霉菌和毛霉目菌，其中對(duì)曲霉菌的鑒定效果最好，鑒定準(zhǔn)確率可以達(dá)到98.4%[19]，與Bile等[15]的鑒定效果相當(dāng)（98.4%）。Chen等[20]也使用MALDITOF MS技術(shù)成功識(shí)別了6種青霉菌屬菌株。De Carolis等[9]通過(guò)103株絲狀真菌（曲霉菌、鐮刀菌、毛霉目菌）質(zhì)譜鑒定對(duì)MALDI-TOF MS技術(shù)進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)94株已知菌中，91株能鑒定到菌種水平，其余3株鑒定到菌屬水平。

MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)少見(jiàn)絲狀真菌也可以達(dá)到較好的鑒定效果，Lau等[13]通過(guò)甲酸乙腈提取技術(shù)對(duì)421株固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的包括76個(gè)菌屬和152個(gè)菌種的絲狀真菌（其中涵蓋了少見(jiàn)絲狀真菌，包括莖點(diǎn)霉、尖端賽多孢、疣狀瓶霉、擔(dān)子類(lèi)菌、球毛殼菌等）進(jìn)行鑒定，然后在菌種水平鑒定出370株（88.9%），在菌屬水平鑒定出388株（92.2%），33株鑒定結(jié)果不可信，其中8株青霉菌不在菌種數(shù)據(jù)庫(kù)中，其余25株為與臨床疾病無(wú)關(guān)的擔(dān)子菌。因此，根據(jù)臨床需要，MALDI-TOF MS技術(shù)須要不斷擴(kuò)充并完善質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

4 MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定絲狀真菌的影響因素

MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定絲狀真菌的影響因素包括取材部位、指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)及提取方法等。

4.1 取材部位 根據(jù)絲狀真菌的菌落特征分為孢子和菌絲兩個(gè)部位，二者鑒定效果不同，由于絲狀真菌孢子細(xì)胞壁比較厚，孢子壁不易溶解導(dǎo)致蛋白析出困難[16]，因此絲狀真菌的鑒定最好選用菌絲部位。Welham等[21]在2000年首次報(bào)道了用MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定青霉菌、雙間柱頂孢霉菌及紅色毛癬菌的孢子，由于真菌孢子破壁困難，結(jié)果僅獲取到少量波峰。同年Li等[22]對(duì)黃曲霉、米曲霉、寄生曲霉及醬油曲霉的孢子進(jìn)行研究，結(jié)果表明產(chǎn)黃曲霉素菌株和非產(chǎn)黃曲霉素菌株具有不同的質(zhì)譜波峰圖，該方法同樣適用于曲霉菌、和鐮刀菌屬的鑒定[23-25]。菌絲部位細(xì)胞壁較孢子部位薄，破壁效果相對(duì)較好，Li等[26]對(duì)381株曲霉菌的菌絲進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論分值如何變化，MALDI-TOF MS技術(shù)的鑒定準(zhǔn)確率都可以達(dá)到89.0%。同樣，Lau等[13]對(duì)421株絲狀真菌的菌絲的研究中鑒定準(zhǔn)確率也達(dá)到了93.2%。

4.2 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù) MALDI-TOF MS技術(shù)中完整的真菌指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)是保證鑒定結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。值得注意的是，不同菌種之間甚至在同種真菌不同菌株之間，真菌細(xì)胞壁和孢子的組成也呈現(xiàn)出定性和定量的差異[11]。因此，鑒定結(jié)果取決于指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中某一菌種的菌株數(shù)量，但De Carolis 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，臨床分離的絲狀真菌鑒定通常與數(shù)據(jù)庫(kù)中很少（或甚至1個(gè)）的參考圖譜比對(duì)。除了Bille等[15]和 Iriart等[16]運(yùn)用了Andromas和Vitek MS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定外，其他研究者均在上述兩種數(shù)據(jù)庫(kù)基礎(chǔ)上對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了擴(kuò)增。鑒定錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)研究往往是因?yàn)閰⒖嫉闹讣y圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)不存在該菌質(zhì)譜指紋圖譜[8]。

此外，為了實(shí)現(xiàn)同種菌種不同菌齡的準(zhǔn)確鑒定，Alanio 等[27]運(yùn)用了一個(gè)由新生菌落和成熟菌落作為參考菌株的指紋圖譜，并建立了特定物種的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，然后用124株臨床曲霉菌和16株環(huán)境曲霉菌對(duì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到了98.6%（138/140），特異度達(dá)到了100%，該數(shù)據(jù)庫(kù)可以鑒定不同成熟度的菌落。在Alanio研究的基礎(chǔ)上，De Carolis等[9]建立了一個(gè)大型的與臨床絲狀真菌相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)用于MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)物種的分析。數(shù)據(jù)庫(kù)的指紋圖譜來(lái)自于109株菌種的新生和成熟菌落，其中涵蓋了55種絲狀真菌（33種曲霉菌、12種鐮刀菌、10種毛霉目菌）。進(jìn)一步用103株絲狀真菌評(píng)估這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)分子測(cè)序的方法對(duì)MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定結(jié)果的可靠性進(jìn)行評(píng)定。除了數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有包含的9株絲狀真菌外，MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)菌種水平的準(zhǔn)確鑒定率達(dá)到了96.8%（91/94），其余3株僅鑒定到了菌屬的水平 。為了增加指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中菌種的涵蓋面，Lau等[13]進(jìn)一步建立了一個(gè)綜合性的數(shù)據(jù)庫(kù)（294株絲狀真菌分離株包括76個(gè)菌屬和152個(gè)菌種），當(dāng)用421株臨床分離真菌來(lái)對(duì)這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行評(píng)估時(shí)，數(shù)據(jù)達(dá)到了菌種水平和菌屬水平的精準(zhǔn)鑒定，其鑒定準(zhǔn)確率分別為370株（88.9%）和388株（93.2%）。

擴(kuò)充數(shù)據(jù)的研究在近幾年逐漸增加，并且均取得了滿意的鑒定效果。2017年西班牙一個(gè)實(shí)驗(yàn)室用390株曲霉菌對(duì)自建數(shù)據(jù)庫(kù)做了驗(yàn)證分析，其中95.5%達(dá)到了菌種水平，4.5%達(dá)到了菌屬水平[28]。同樣，Triest等[29]在對(duì)自建數(shù)據(jù)庫(kù)的研究中獲得了91%的菌種鑒定率，因此，實(shí)驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫(kù)具有更好的特異性和準(zhǔn)確性，不斷完善質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)是實(shí)現(xiàn)MALDI-TOF MS技術(shù)快速、準(zhǔn)確鑒定絲狀真菌的有力保障。

4.3 提取方法 為了優(yōu)化MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)絲狀真菌的常規(guī)鑒定方法，Cassagne 等[30]制定了一個(gè)詳細(xì)的鑒定程序，用沙保弱-慶大-氯霉素瓊脂對(duì)絲狀真菌進(jìn)行培養(yǎng)，用甲酸乙腈提取絲狀真菌菌落，絲狀真菌鑒定到菌種水平的準(zhǔn)確率達(dá)到87%。鑒定失敗的菌株是由于數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜指紋圖譜，1株白僵菌未能鑒定出結(jié)果和1株米根霉菌錯(cuò)誤鑒定成了卷枝毛霉菌。Coulibaly等[31]在對(duì)甲酸乙腈和三氟乙酸2種提取方法進(jìn)行比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)甲酸乙腈提取效果和三氟乙酸的提取效果相似，但是甲酸乙腈提取法具有更快、毒性更小等優(yōu)點(diǎn)。Alanio 等[27]在之前的研究成果之上制定了一個(gè)簡(jiǎn)單快速的鑒定方案：直接用絲狀真菌的孢子、分生孢子、菌絲混合在水中，然后將水混合物點(diǎn)靶。研究顯示，直接點(diǎn)靶技術(shù)也可以得到質(zhì)譜指紋圖譜[32]。Park等[33]在用甲酸乙腈提取蛋白的方法對(duì)345株曲霉菌鑒定的研究中，菌種的鑒定率達(dá)到了94.5%（326/345），菌屬鑒定率達(dá)到了98.8%（341/345）。雖然甲酸乙腈提取蛋白的實(shí)驗(yàn)方法可以獲得較好的結(jié)果[13]，但是當(dāng)?shù)鞍滋崛》椒ū粡V泛用于絲狀真菌質(zhì)譜鑒定的時(shí)候，顯現(xiàn)出一個(gè)重要的問(wèn)題：孢子產(chǎn)生的氣溶膠會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生潛在的感染或者污染，故整個(gè)活菌的操作過(guò)程必須在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，且不能同時(shí)進(jìn)行多種真菌的操作，以免交叉污染。

4.4 其他影響因素 為了獲得均一的菌絲從而得到更加清晰的質(zhì)譜圖譜，布魯克公司在建立單獨(dú)的絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)采用了沙保弱液體培養(yǎng)基培養(yǎng)絲狀真菌[11]。雖然液體培養(yǎng)法減少了培養(yǎng)條件的影響并且可以獲得均一的菌絲體，同時(shí)也減少大多數(shù)菌種色素和次代謝物的產(chǎn)生[30]。但是該方法很少用于臨床真菌實(shí)驗(yàn)室，因?yàn)樗嬖陟F化孢子污染的風(fēng)險(xiǎn)以及無(wú)法顯現(xiàn)表型的宏觀和微觀特征[34]。

另外，液體培養(yǎng)難以檢測(cè)到污染或與其他霉菌共同的感染。固體培養(yǎng)絲狀真菌不僅在臨床真菌實(shí)驗(yàn)室廣泛使用，而且易于檢測(cè)到污染。收集絲狀真菌樣本時(shí)，固體培養(yǎng)基比液體培養(yǎng)基在制備過(guò)程上更加簡(jiǎn)化，節(jié)省時(shí)間[34-35]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)鑒定結(jié)果具有至關(guān)重要的作用，Li等[26]對(duì)381株的曲霉菌的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌種的評(píng)分臨界值從≥2.0改為≥1.7時(shí)，菌種鑒定率就從30.2%上升到了79.5%；因此，在鑒定曲霉菌的時(shí)候可以降低BURKER的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。由于絲狀真菌的生長(zhǎng)條件（時(shí)間、溫度、培養(yǎng)基）的改變會(huì)影響它的形態(tài)特征，因此，Zhou等[36]在52株煙曲霉的研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)間（48、72、96、120 h）對(duì)質(zhì)譜鑒定效果的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中培養(yǎng)48 h的鑒定效果較其他3組差。但研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是生長(zhǎng)在沙保弱液體培養(yǎng)基、沙保弱瓊脂培養(yǎng)基還是Chalet瓊脂培養(yǎng)基的煙曲霉，對(duì)質(zhì)譜鑒定效果的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同樣，培養(yǎng)溫度28 ℃和35 ℃對(duì)鑒定效果亦無(wú)影響。MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定絲狀真菌影響因素較多，因此條件探索仍須做進(jìn)一步研究。

5 MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定絲狀真菌的展望

MALDI-TOF MS技術(shù)操作簡(jiǎn)單、成本低廉、鑒定準(zhǔn)確、鑒定周期短，在全世界應(yīng)用越來(lái)越廣泛，并將逐漸取代傳統(tǒng)的鑒定方法。由于絲狀真菌存在種類(lèi)繁多，破壁困難，易污染及影響因素多等諸多問(wèn)題，故找到優(yōu)化條件，制定統(tǒng)一的操作規(guī)范，提高M(jìn)ALDI-TOF MS技術(shù)鑒定絲狀真菌的能力還有待繼續(xù)研究，并且絲狀真菌的數(shù)據(jù)庫(kù)還須要不斷完善，鑒定方法和培養(yǎng)時(shí)間也須要做進(jìn)一步的探索和研究。實(shí)驗(yàn)室可以結(jié)合自身特點(diǎn)，建立個(gè)性化數(shù)據(jù)庫(kù)，從而提高鑒定的陽(yáng)性率和準(zhǔn)確率。隨著研究的不斷深入，經(jīng)驗(yàn)的逐步積累，相信MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室絲狀真菌的快速鑒定中會(huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

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