劉國(guó)明，萬夢(mèng)雪，賈萌萌，王慧峰，胡文友，黃 標(biāo)*

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異噻唑啉酮對(duì)土壤微生物殺滅效果及其影響因素初探①

劉國(guó)明1,2，萬夢(mèng)雪1,2，賈萌萌1,2，王慧峰1,2，胡文友1，黃 標(biāo)1*

(1 中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

異噻唑啉酮?dú)⒕鷦┦且活愋滦偷母咝⒕鷦瑥V泛應(yīng)用于個(gè)人洗護(hù)用品、制藥、水處理等領(lǐng)域，但是目前其對(duì)土壤微生物的殺滅效果和影響因素尚不明確。本文將異噻唑啉酮?dú)⒕鷦┛ㄋ?Kathon)CG用于土壤滅菌，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定了供試土壤加入卡松CG前后細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量變化，以評(píng)估卡松CG對(duì)土壤微生物殺滅效果，并考察了卡松CG濃度、pH、溫度、時(shí)間等對(duì)殺滅效果的影響。結(jié)果表明：卡松CG對(duì)兩種土壤中放線菌殺滅率均為100%，對(duì)細(xì)菌、真菌的殺滅率隨卡松CG濃度的升高而增大，當(dāng)卡松CG濃度由0.5 ml/L 升至3.0 ml/L時(shí)，對(duì)風(fēng)干土壤中細(xì)菌、真菌的殺滅率分別由84.1%、78.0% 升至98.7%、99.6%，卡松CG濃度升至5.0 ml/L 時(shí)，對(duì)細(xì)菌和真菌殺滅率接近100%；當(dāng)卡松CG濃度較低(<3.0 ml/L)時(shí)對(duì)新鮮土壤中細(xì)菌和真菌殺滅率與風(fēng)干土壤相比有所下降，此時(shí)過高的pH也會(huì)降低細(xì)菌和真菌的殺滅率，但當(dāng)卡松CG濃度>3.0 ml/L時(shí)，對(duì)風(fēng)干土壤和新鮮土壤中細(xì)菌、真菌殺滅率均>99.0%，pH對(duì)殺滅率影響較小；土壤溫度(25 ~ 50℃)對(duì)土壤細(xì)菌殺滅效果沒有影響，且卡松CG對(duì)土壤細(xì)菌殺滅作用持續(xù)時(shí)效>72 h。本研究表明，卡松CG可以在較低濃度下有效殺滅土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌，殺滅效果在25 ~ 50℃內(nèi)保持穩(wěn)定，受土壤pH影響較小。采用卡松CG可以作為土壤研究中控制生物因素的備選方法之一。

異噻唑啉酮；卡松CG；土壤微生物；土壤滅菌

土壤滅菌是指殺滅或清除土壤中微生物的過程，通常用于土壤微生物生物量、酶活性、土壤呼吸作用的測(cè)定[1-2]，土壤微生物學(xué)檢驗(yàn)，以及土壤中外源物質(zhì)的降解、吸附試驗(yàn)等過程中對(duì)生物與非生物反應(yīng)過程的區(qū)分[3]。目前實(shí)驗(yàn)室常用的土壤滅菌方法主要有物理方法和化學(xué)方法。物理方法主要有高壓蒸汽滅菌、γ射線滅菌、干熱滅菌、微波滅菌等，化學(xué)方法主要有氯仿(或溴甲烷、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷等)熏蒸滅菌，以及向土壤中加入NaN3或HgCl2等[[1, 3-6]。針對(duì)不同的研究目的，上述滅菌方法各有利弊。

研究顯示，土壤滅菌過程通常會(huì)導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)的改變[4]，從而影響對(duì)土壤中生物因素和非生物因素的區(qū)分[7]。高壓蒸汽滅菌和γ射線滅菌會(huì)改變土壤團(tuán)聚體團(tuán)聚狀態(tài)，導(dǎo)致土壤表面積增加和土壤有機(jī)質(zhì)中碳水化合物和烷基氮含量降低[3]；γ射線滅菌還會(huì)導(dǎo)致土壤中硝態(tài)氮和氨態(tài)氮含量的變化，其滅菌效果也會(huì)受到土壤含水量和γ射線輻射劑量的影響[8-9]；高壓蒸汽滅菌對(duì)土壤性質(zhì)的改變程度受土壤類型的影響，例如砂質(zhì)潮土和紅壤高溫高壓滅菌會(huì)造成土壤有機(jī)質(zhì)顯著增加，而對(duì)其他類型土壤影響不大[10]。此外，高壓蒸汽滅菌等物理方法通常需要對(duì)土壤多次處理，處理時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜[6]；γ射線滅菌也存在輻射時(shí)間較長(zhǎng)等不足[6]；干熱滅菌會(huì)造成土壤可溶性有機(jī)質(zhì)的濃度增加和土壤pH改變[4]。有研究指出，CaCl2介質(zhì)中的土壤pH會(huì)隨著土壤干燥溫度的升高而降低[11]；Razavi和Lakzian[7]比較了不同滅菌方法對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高壓蒸汽滅菌、氯仿熏蒸、紫外和微波滅菌4種方法均造成土壤pH、電導(dǎo)率、陽(yáng)離子交換量、土壤有機(jī)質(zhì)、土壤全氮等指標(biāo)的變化?；瘜W(xué)滅菌方法中，環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷熏蒸滅菌會(huì)導(dǎo)致土壤pH升高[12]，熏蒸時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)也會(huì)破壞大氣臭氧層[13-14]。與高壓蒸汽滅菌等物理方法相比，向土壤加入HgCl2、NaN3等殺菌劑抑制土壤微生物活性可能更加便于操作，但土壤中加入HgCl2會(huì)引入重金屬元素Hg，而加入NaN3(或KN3)會(huì)導(dǎo)致土壤pH升高，土壤中的疊氮化物也會(huì)轉(zhuǎn)變成有毒的疊氮酸[2]，這些均會(huì)造成土壤性質(zhì)的變化。Wolf等[6]也比較了多種滅菌方法對(duì)土壤性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)環(huán)氧丙烷處理后會(huì)使土壤表面積顯著減小，環(huán)氧丙烷和NaN3會(huì)造成土壤pH的升高。綜上所述，土壤滅菌過程均可能引起土壤性質(zhì)的改變[4,5,12]，因此，根據(jù)研究目的選擇合適的滅菌方法，減少滅菌過程對(duì)土壤其他性質(zhì)和目標(biāo)物的影響成為土壤滅菌方法選擇的關(guān)鍵點(diǎn)[3-4]。

合適的土壤滅菌方法需滿足以下要求：①滅菌效果好；②對(duì)土壤物理、化學(xué)和結(jié)構(gòu)等性質(zhì)改變程度小；③滅菌方法操作簡(jiǎn)便；④材料廉價(jià)、易得且環(huán)境友好。異噻唑啉酮是指含有異噻唑啉酮雜環(huán)的一系列化合物，是一類新型的高效殺菌劑。卡松(Kathon)CG是活性成分為5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMI)和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MI)(化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示)的殺菌劑的商品名稱[15-17]，卡松CG具有以下特點(diǎn)：對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、霉菌及酵母菌均有殺滅作用，活性強(qiáng)，pH適應(yīng)范圍廣，環(huán)境友好[18]，在洗化用品、藥業(yè)、涂料、水處理等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[19]。文獻(xiàn)表明，Gandhi等[20]運(yùn)用生物增強(qiáng)型反應(yīng)墻處理復(fù)合污染的地下水，以及Silva等[21]在研究苯系物自然衰減過程中，將卡松CG用于區(qū)分反應(yīng)中的生物因素，此后，Du等[22]在飲用水處理時(shí)也將加入卡松的水溶液作為對(duì)照試驗(yàn)。但是，目前卡松CG對(duì)土壤微生物殺滅效果尚不明確。本文選擇風(fēng)干土壤和新鮮土壤樣品為代表，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法考察了不同條件下卡松CG處理前后土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量變化，旨在進(jìn)一步了解卡松CG對(duì)土壤微生物的殺滅效果和影響因素，為卡松CG在土壤滅菌中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 卡松CG中有效成分化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤：供試土壤為風(fēng)干土壤和新鮮土壤樣品，風(fēng)干土壤樣品采自中國(guó)科學(xué)院封丘農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)試驗(yàn)站表層(0 ~ 15 cm)小麥-玉米輪作農(nóng)田土壤，土壤類型為潮土，土壤樣品按照蛇形法取5個(gè)點(diǎn)，采樣土壤剔除雜物及殘留根系，混合均勻，采用四分法取土樣1 kg，在室溫下風(fēng)干，然后將土樣壓碎過2 mm篩放于密封袋中保存?zhèn)溆?；新鮮土壤樣品采自南京城郊表層(0 ~ 15 cm)草地土壤，采集的新鮮土壤樣品剔除雜物及殘留根系，混合均勻，采用四分法取土樣1.5 kg，將樣品過2 mm篩后置于4℃條件下保存?zhèn)溆?。供試土壤的基本性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤基本屬性

卡松CG及培養(yǎng)基：卡松CG由廣州敏航化工科技有限公司提供；LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基由青島海博生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 不同濃度卡松CG對(duì)土壤微生物的殺滅效果 每個(gè)處理稱取5.0 g風(fēng)干土壤(和相當(dāng)于5.0 g風(fēng)干土壤質(zhì)量的新鮮土壤)置于100 ml錐形瓶中，加入45 ml去離子水；將錐形瓶置于搖床以200 r/min，25℃充分振蕩20 min后取出，靜置過夜；去除土壤懸液表面漂浮的草木屑等雜物，分別向其中加入0.5、1.0、3.0、5.0、7.0 ml/L5個(gè)濃度的卡松CG；再次置于搖床上200 r/min振蕩20 min，然后取0.1 ml土壤懸液分別涂布于LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基和改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基中，在28 ~ 30℃條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，測(cè)定微生物數(shù)量。對(duì)照組不加卡松CG，其余處理步驟均與試驗(yàn)組處理方法相同。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 不同pH條件下卡松CG對(duì)土壤微生物的殺滅效果 每個(gè)處理稱取5.0 g風(fēng)干土壤置于100 ml錐形瓶中，加入45 ml去離子水；置于搖床以200 r/min，25℃充分振蕩20 min后取出，靜置過夜；去除土壤懸液表面漂浮的草木屑等雜物，取其中一份測(cè)定土壤懸液pH為8.12，然后將其余土壤懸液用1.0 mol/L的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)pH至3.07、9.93和10.97穩(wěn)定后，向上述土壤懸液中分別加入0.5、1.0、3.0、5.0、7.0 ml/L的卡松CG；再次置于搖床以200 r/min振蕩20 min，然后取0.1 ml土壤懸液涂布于和1.2.1中相同的3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間，測(cè)定微生物數(shù)量。每個(gè)土壤樣品重復(fù)3次。

1.2.3 不同溫度條件下卡松CG對(duì)土壤細(xì)菌的殺滅效果 每個(gè)處理稱取5.0 g風(fēng)干土壤置于100 ml錐形瓶中，加入45 ml去離子水，置于搖床200 r/min，25℃充分振蕩20 min后取出，靜置過夜；去除土壤懸液表面漂浮的草木屑等雜物，將4份土壤懸液分別放置于在25、35、45和50℃環(huán)境中，然后分別加入3.0、5.0 ml/L的卡松CG，置于搖床以200 r/min分別在25、35、45和50℃條件下振蕩20 min，然后取0.1 ml 土壤懸液涂布于LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間，測(cè)定微生物數(shù)量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 卡松CG對(duì)土壤細(xì)菌的殺滅時(shí)效 將1.2.2中加入卡松CG的土壤懸液在室溫下靜置72 h后，再次搖床以200 r/min振蕩20 min，然后接種培養(yǎng)，比較卡松CG處理后立即接種(時(shí)間<2 h)培養(yǎng)與靜置72 h接種培養(yǎng)后菌落數(shù)量的不同。

1.3 分析方法

1.3.1 微生物數(shù)量測(cè)定方法 微生物計(jì)數(shù)采用稀釋平板計(jì)數(shù)法[23]。細(xì)菌采用LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，在28 ~ 30℃條件下培養(yǎng)24 h；真菌采用改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，在28 ~ 30℃條件下培養(yǎng)24 h，放線菌采用改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基，在28 ~ 30℃條件下培養(yǎng)120 h，然后對(duì)平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與不加卡松CG土壤懸液接種培養(yǎng)的培養(yǎng)基相比，加入卡松CG后的土壤懸液接種培養(yǎng)的培養(yǎng)基中菌落數(shù)量大幅減少，卡松CG濃度為0.5 ml/L時(shí)，LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中最高的菌落數(shù)量為353 CFU，當(dāng)卡松CG濃度高于0.5 ml/L時(shí)，3種培養(yǎng)基中的菌落數(shù)量均小于300 CFU，因此，對(duì)加入卡松CG的10–1稀釋度的土壤懸液可直接涂布，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)測(cè)定殘留菌落數(shù)量。

1.3.2 土壤基本性質(zhì)測(cè)定方法 土壤pH(水土比為2.5∶1)采用電位法測(cè)定(NY/T1121.2-2006)；土壤質(zhì)地采用激光粒度儀(Beckman Coulter, Inc. LS-13320)測(cè)定；土壤含水量采用烘干法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌殺滅率(killing rate，KR)的計(jì)算公式如下：

式中：KR為殺滅率，%；為試驗(yàn)組中殘留菌落數(shù)，CFU/ml；a為對(duì)照組中菌落數(shù)，CFU/ml。試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與pH為8.12時(shí)土壤懸液相比，當(dāng)pH調(diào)節(jié)至3.07、9.93和10.97時(shí)土壤懸液接種后平板中菌落數(shù)量相應(yīng)減少，因此，本文扣除了土壤pH變化對(duì)土壤中菌落數(shù)量的影響，然后計(jì)算殺滅率。

參考SN/T 3229-2012行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，3種平板中菌落數(shù)量計(jì)算公式如下：

式中：為全部平板上的菌落總數(shù)之和為用于計(jì)數(shù)的平板數(shù)量；為稀釋因子，土壤懸液的稀釋因子為10-1；為接種樣品的體積，ml。

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，殺滅率經(jīng)過平方根反正弦轉(zhuǎn)換后再做方差分析(ANOVA)，處理平均數(shù)采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(=0.05)，采用OriginPro 9.1繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡松CG濃度對(duì)土壤中微生物殺滅效果的影響

卡松CG濃度對(duì)風(fēng)干土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌殺滅率的影響如圖2所示，卡松CG在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)土壤中放線菌殺滅率均為100%，殺滅率不受卡松CG濃度和pH的影響?？ㄋ蒀G對(duì)土壤中細(xì)菌、真菌殺滅率隨卡松CG濃度的增加而升高，卡松CG濃度達(dá)到3.0 ml/L 時(shí)，卡松CG對(duì)風(fēng)干土壤中細(xì)菌、真菌殺滅率基本達(dá)到穩(wěn)定，殺滅率>98%，當(dāng)卡松CG濃度達(dá)到5.0 ml/L 以上時(shí)，卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌和真菌殺滅率>99.8%?？梢姡ㄋ蒀G對(duì)土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌均具有良好的殺滅效果。

(圖中不同卡松CG濃度下的殺滅率為pH= 3.07、8.12、9.93、10.97時(shí)的平均殺滅率)

通過對(duì)兩種土壤中微生物殺滅率的比較，發(fā)現(xiàn)卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌和真菌殺滅率均隨卡松CG濃度的增加而升高(圖3)，卡松CG濃度由0.5 ml/L 升至1.0 ml/L 時(shí)，對(duì)風(fēng)干土壤和新鮮土壤中細(xì)菌殺滅率分別由87.6% 和64.0% 升至93.7% 和74.2%；卡松CG濃度為0.5 ml/L 和1.0 ml/L 時(shí)，卡松CG對(duì)風(fēng)干土壤中細(xì)菌和真菌殺滅率顯著高于對(duì)新鮮土壤中細(xì)菌和真菌的殺滅率(<0.01)；當(dāng)卡松CG濃度增至3.0 ml/ L時(shí)，卡松CG對(duì)風(fēng)干土壤中真菌殺滅率仍然高于新鮮土壤(<0.05)，卡松CG濃度>5.0 ml/L 時(shí)對(duì)兩種土壤中細(xì)菌和真菌殺滅率均>99%，此時(shí)卡松CG對(duì)新鮮土壤和風(fēng)干土壤中細(xì)菌、真菌殺滅率不存在顯著差異，當(dāng)增加卡松CG濃度至7.0 ml/L 時(shí)，對(duì)兩種土壤中細(xì)菌、真菌的殺滅率均為100%。卡松CG在5.0 ~ 7.0 ml/L范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)土壤中的放線菌殺滅率均達(dá)到100%，這進(jìn)一步表明卡松CG對(duì)放線菌的殺滅率不受土壤條件和卡松CG濃度的影響。

2.2 pH對(duì)卡松CG殺滅土壤微生物效果的影響

pH對(duì)卡松CG殺滅土壤微生物效果的影響結(jié)果見表2。可以看出，當(dāng)卡松CG濃度較低(<3.0 ml/L)時(shí)，土壤懸液過低的pH(pH=3.07)對(duì)土壤中細(xì)菌和真菌的殺滅率影響均不顯著，而過高的pH(pH=10.97)會(huì)顯著降低卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌和真菌的殺滅率(<0.05)；當(dāng)卡松CG濃度較高(>3.0 ml/L)時(shí)，卡松CG對(duì)細(xì)菌殺滅率在pH為3.07、8.12、9.93和10.97時(shí)不存在顯著差異?？ㄋ蒀G濃度為0.5 ml/L 和1.0 ml/L，土壤懸液pH為10.97時(shí)，卡松CG對(duì)細(xì)菌的殺滅率比pH為8.12時(shí)分別下降了21.23% 和18.46%，此時(shí)卡松CG對(duì)細(xì)菌殺滅率顯著低于pH為3.07、8.12、9.93時(shí)，而卡松CG對(duì)細(xì)菌的殺滅率在pH為3.07、8.12、9.93時(shí)不存在顯著差異。當(dāng)卡松CG濃度高于3.0 mL/L 時(shí)，不同pH對(duì)細(xì)菌殺滅率的影響均不存在顯著差異。由表2可知，卡松CG對(duì)土壤中真菌殺滅率受到土壤懸液高pH的影響較大，卡松CG濃度為0.5 ml/L 和1.0 ml/L 時(shí)，pH為10.97時(shí)卡松CG對(duì)真菌的殺滅率比pH為8.12時(shí)分別下降了46.12% 和21.57%，此時(shí)卡松CG對(duì)真菌殺滅率顯著低于pH為3.07、8.12、9.93時(shí)對(duì)真菌殺滅率；當(dāng)卡松CG濃度高于3.0 ml/L 時(shí)對(duì)土壤中真菌的殺滅率均>99%。

(圖中不同小寫字母表示相同土壤不同卡松CG濃度處理間差異在P<0.05水平顯著)

表2 不同處理對(duì)卡松CG殺滅細(xì)菌和真菌效果的影響(%)

注： 同一列中不同小寫字母表示相同卡松CG濃度時(shí)不同pH處理間的差異顯著(<0.05)；下同?？ㄋ蒀G對(duì)放線菌殺滅率均為100%，數(shù)據(jù)未顯示。

2.3 溫度對(duì)卡松CG殺滅土壤細(xì)菌效果的影響

由圖3可知，當(dāng)卡松CG濃度為0.5、1.0和3.0 ml/L 時(shí)對(duì)風(fēng)干土壤中細(xì)菌殺滅率菌分別為87.6%、93.7% 和99.9%，當(dāng)卡松CG濃度為0.5 ml/L 和1.0 ml/L 時(shí)不能滿足殺滅土壤微生物的要求，因此，考察溫度對(duì)土壤中細(xì)菌殺滅效果的影響時(shí)選擇卡松CG濃度為3.0 ml/L 和5.0 ml/L。由表3可知，與25℃時(shí)相比，在45、50℃時(shí)卡松CG對(duì)細(xì)菌殺滅率均高于99.9%，此時(shí)，不同溫度處理間卡松CG對(duì)殺滅率的影響不存在顯著差異，卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌殺滅率不受溫度的影響。

表3 不同溫度處理卡松CG對(duì)土壤細(xì)菌的殺滅效果

2.4 卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌的殺滅時(shí)效

卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌殺滅效果的持續(xù)時(shí)間如圖4所示。隨著土壤中加入卡松CG后作用時(shí)間的延長(zhǎng)，卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌的殺滅率升高，卡松CG濃度為0.5、1.0 和3.0 ml/L，土壤懸液pH分別為3.07、8.12、9.93和10.97時(shí)，同一土壤樣品加入卡松CG作用72 h后與作用時(shí)間小于2 h相比，卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌殺滅率有顯著提高，在試驗(yàn)的卡松CG濃度和土壤懸液pH范圍內(nèi)，卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌的殺滅效果有效時(shí)間維持在72 h以上。

(圖中土壤樣品編號(hào)中數(shù)字1、2和3依次代表卡松CG濃度為0.5、1.0、3.0 ml/L，字母a、b、c和d分別表示土壤pH為3.07、8.12、9.93和10.97)

3 討論

3.1 卡松CG濃度對(duì)土壤微生物殺滅效果的影響

隨著卡松CG濃度的增加，其對(duì)土壤中細(xì)菌和真菌的殺滅率呈顯著增加的趨勢(shì)，當(dāng)卡松CG濃度為0.5 ml/L 和1.0 ml/L 時(shí)，卡松CG對(duì)風(fēng)干土壤中細(xì)菌和真菌殺滅率顯著高于新鮮土壤，可能的原因是卡松CG濃度較低時(shí)不能完全殺滅土壤中的細(xì)菌和真菌，而新鮮土壤比風(fēng)干土壤中蘊(yùn)含的細(xì)菌和真菌數(shù)量更多，造成低濃度卡松CG處理的新鮮土壤懸液中殘留更多數(shù)量的微生物；卡松CG對(duì)放線菌殺滅率均為100%，不受卡松CG濃度的影響。

與卡松CG相比，HgCl2作為土壤殺菌劑時(shí)通常加入濃度是500 mg/kg土壤[24]，也有研究者采用的HgCl2濃度為50、90或176 mg/L[25]，Wolf等[6]認(rèn)為HgCl2控制土壤微生物活性對(duì)土壤的物理和化學(xué)性質(zhì)改變最小。NaN3用于控制土壤微生物活動(dòng)時(shí)，不同研究者添加的濃度范圍相差較大，添加濃度一般在0.002% ~ 2%[26-28]，但是許多文獻(xiàn)中并未說明所使用的NaN3濃度是否足以抑制土壤中微生物活性[29-30]。有研究指出，當(dāng)NaN3添加濃度為100、200、500或650 mg/L時(shí)，可以有效降低土壤中微生物活性，其中650 mg/L為常用濃度。Chefetz等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在NaN3共存條件下，除草劑阿特拉津的濃度會(huì)隨時(shí)間顯著下降，NaN3對(duì)阿特拉津的轉(zhuǎn)化會(huì)顯著影響土壤中除草劑的吸附，因此他們認(rèn)為在吸附/解吸試驗(yàn)中應(yīng)該仔細(xì)評(píng)估使用NaN3作為土壤殺菌劑的可行性，這也可能會(huì)影響NaN3在土壤的吸附/解吸等研究中作為控制生物因素方法的應(yīng)用。卡松CG中含有一定量的硝酸銅和硝酸鎂作為穩(wěn)定劑，但與研究者采用NaN3控制土壤微生物活性相比[29]，在本研究中采用卡松CG濃度3.0 ml/L時(shí)，卡松CG中NO3-濃度為136.67 mg/L，小于采用NaN3時(shí)的濃度，可見卡松CG殺滅土壤微生物時(shí)使用的濃度較低。實(shí)際使用卡松CG殺滅土壤微生物時(shí)，卡松CG中硝酸銅和硝酸鎂在土壤懸液中會(huì)被大大稀釋，但在控制土壤中生物因素時(shí)也應(yīng)考慮其對(duì)研究目標(biāo)的影響。

3.2 pH對(duì)卡松CG殺滅土壤微生物性能的影響

卡松CG具有較大的pH適用范圍[31]，但是目前尚未見考察土壤pH變化時(shí)對(duì)其殺滅土壤微生物性能影響的報(bào)道，此外，采用NaN3、HgCl2對(duì)土壤滅菌的方法中，也很少考慮土壤pH變化可能對(duì)土壤微生物殺滅效果的影響[24,32]。有研究指出MCI和MI在環(huán)境中會(huì)發(fā)生水解和光解作用，體系較高的pH會(huì)縮短MCI和MI的半衰期[33]，由表2可知，當(dāng)卡松CG濃度為0.5、1.0 ml/L，土壤懸液 pH為10.97時(shí)卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌和真菌殺滅率明顯降低，這可能有以下原因：較高的pH可能會(huì)抑制卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌、真菌的殺滅性能，或者較高的pH促進(jìn)了卡松CG中MCI和MI的水解，降低了其對(duì)土壤中細(xì)菌、真菌的殺滅作用。當(dāng)卡松CG濃度增加至3.0 ml/L 時(shí)，卡松CG對(duì)4個(gè)不同pH土壤懸液中細(xì)菌殺滅率不存在顯著差異，表明增加卡松CG濃度可以減少高pH對(duì)其殺滅效果的影響。Rozycki和Bartha[34]研究表明，KN3(或NaN3)在抑制土壤中微生物活性時(shí)會(huì)造成土壤CO2釋放量測(cè)定錯(cuò)誤，KN3(或NaN3)濃度的變化，會(huì)造成土壤pH的升高，同時(shí)在酸性環(huán)境下產(chǎn)生的疊氮酸是揮發(fā)性毒物，并且當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)會(huì)有爆炸危險(xiǎn)，而HgCl2與KN3(或NaN3)共同使用時(shí)會(huì)形成高爆炸性的疊氮化汞，與此相比，卡松CG具有使用安全、環(huán)境友好的特征，其在濃度>3.0 ml/L時(shí)可以在較大的pH范圍內(nèi)保持對(duì)土壤微生物殺滅活性。

3.3 溫度和時(shí)間對(duì)卡松殺滅土壤中細(xì)菌的影響

異噻唑啉酮在環(huán)境中會(huì)發(fā)生揮發(fā)、降解[33,35]，Rafoth等[16]研究了異噻唑啉酮衍生物在不同水環(huán)境中的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將異噻唑啉酮加入河水和自來水中保存在室溫(23℃)環(huán)境中時(shí)與4℃保存時(shí)相比降解得更快，升高溫度可能會(huì)促進(jìn)異噻唑啉酮的揮發(fā)和降解，因此，溫度可能影響卡松CG對(duì)土壤微生物的殺滅效果。本研究表明，在卡松CG濃度為3.0 ml/L和5.0 ml/L時(shí)，土壤分別在25、45和50℃條件下處理時(shí)，卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌殺滅率均>99%。同時(shí)，土壤懸液在加入卡松CG放置72 h后，卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌的殺滅效果并沒有隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，說明卡松CG具有持效性。有研究指出，土壤中加入KN3后，揮發(fā)是導(dǎo)致其損耗的一個(gè)重要因素，在酸性環(huán)境中可能由于快速轉(zhuǎn)化為HN3而增大KN3的揮發(fā)性，升高溫度也會(huì)加快KN3的損耗[36]，NaN3與KN3性質(zhì)相似，因此，當(dāng)使用NaN3抑制土壤中微生物活性時(shí)，不同土壤環(huán)境條件下NaN3的損耗可能會(huì)影響其在土壤滅菌中的效果。

4 結(jié)論

卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌、真菌的殺滅率隨卡松CG濃度的增加而升高。當(dāng)卡松CG濃度>3.0 ml/L時(shí)，對(duì)風(fēng)干土壤和新鮮土壤中細(xì)菌、真菌殺滅率>98%；當(dāng)卡松CG濃度在0.5 ~ 7.0 ml/L時(shí)對(duì)兩種土壤中放線菌殺滅率均為100%。在卡松CG濃度為0.5 ~ 1.0 ml/L時(shí)，過高的土壤pH會(huì)導(dǎo)致卡松CG對(duì)土壤細(xì)菌、真菌的殺滅效果有所降低，但是當(dāng)卡松CG濃度>3.0 ml/L時(shí)，pH對(duì)卡松CG殺滅土壤細(xì)菌、真菌的影響較小。在25 ~ 50℃范圍內(nèi)，卡松CG對(duì)土壤中細(xì)菌的殺滅效果不受土壤溫度的影響，殺滅效果持續(xù)時(shí)效>72 h，并對(duì)土壤pH有較大的適應(yīng)范圍?？傮w而言，本研究中使用的卡松CG對(duì)土壤中微生物具有良好的殺滅效果，卡松CG可以作為土壤研究中控制生物因素的備選方法之一。

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Effectiveness and Influence Factors of Isothiazolinones in Soil Sterilization

LIU Guoming1,2, WAN Mengxue1,2, JIA Mengmeng1,2, WANG Huifeng1,2, HU Wenyou1, HUANG Biao1*

(1 Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Isothiazolinones are a group of effective biocides, which are widely used in personal hygiene, pharmaceutical and water treatment products, but their application effects for soil sterilization are still unclear. In this paper, a commercially sold isothiazolinone biocides Kathon CG was tested for soil sterilization. The populations of bacteria, fungi and actinomycetes in tested soil were determined before and after isothiazolinone application at different concentrations, soil suspension pH values and temperatures for two durations of equilibration time. The results showed that the killing rates of actinomycetes in the tested soils were 100%, and the killing rates of bacteria and fungi in the tested soils increased with the increase of Kathon CG concentration. When Kathon CG concentration enhanced from 0.5 ml/L to 3.0 ml/L, the killing rate of bacteria and fungi in air-dried soil increased from 84.1% and 78.0% to 98.7% and 99.6%, respectively, the killing rate of bacteria and fungi was close to 100% when Kathon CG concentration reached to 5.0 ml/L or above. When the concentration of Kathon CG was 0.5 ml/L and 1.0 ml/L, the killing rates of bacteria and fungi for fresh soil declined compared that of the air-dried soil, and in this case, excessive alkaline soil suspension pH also reduced the killing rate of bacteria and fungi. When Kathon CG concentration reached to 3.0 ml/L or above, the killing rate of bacteria and fungi in air-dried soil and fresh soil was over 99.0%, and soil suspension pH had little effect on the killing rate of bacteria and fungi. The ambient temperature (25–50℃) had no influence on the germicidal effect of soil bacferia, and the duration of the bactericidal effect was longer than 72 h. This study shows that Kathon CG can effectively kill bacteria, fungi and actinomycetes in the soil at a low concentration. The germicidal effect remains stable at 25–50℃, less affected by pH of soil suspension. The use of Kathon CG may be one of the alternative methods in inhibiting soil microbial processes.

Isothiazolinones; Kathon CG; Soil microbes; Soil sterilization

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41473073)資助。

(bhuang@issas.ac.cn)

劉國(guó)明(1988—)，男，山東臨沂人，博士研究生，主要從事土壤地球化學(xué)研究。E-mail: gmliu15@issas.ac.cn

10.13758/j.cnki.tr.2018.01.014

S154.3

A