李 雪，田新會(huì)，杜文華

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

小黑麥(Triticalewittmack)為禾本科一年生草本植物，由小麥(Triticum)和黑麥(Secale)經(jīng)屬間有性雜交和雜種染色體加倍而成的新物種，不僅表現(xiàn)了小麥的豐產(chǎn)性和籽粒的優(yōu)良品質(zhì)，又保持了黑麥抗逆性強(qiáng)和賴氨酸含量高的特點(diǎn)，是一種很有前途的糧飼兼用型作物[1-3]。

種子的劣變是指因種子生存能力降低、導(dǎo)致種子喪失生活力和萌發(fā)力的不可逆轉(zhuǎn)變化，是伴隨著種子貯藏時(shí)間延長而發(fā)生的、不可避免的過程[4]。在劣變過程中種子內(nèi)部發(fā)生一系列生理生化變化，種子的各種功能和結(jié)構(gòu)受到損害[5-7]，其損害程度隨時(shí)間延長而逐漸加劇，從而導(dǎo)致種子質(zhì)量下降，種子活力下降，甚至喪失生活力[8-9]。這主要是因?yàn)?，雖然胚具有活力，但胚乳喪失了為胚萌發(fā)提供營養(yǎng)物質(zhì)的能力，從而使胚由于缺乏營養(yǎng)而失去活力[10]。

植物胚是一個(gè)具有全能性的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，通常能夠正常發(fā)育成熟，而且可以直接播種形成完整植株。通過離體胚培養(yǎng)，使可能敗育或退化的胚獲得再生植株，在植物育種中具有十分重要的理論與實(shí)踐意義[11-12]。

胚培養(yǎng)可以追溯到18 世紀(jì)，Charles Bonnet分離并培養(yǎng)了菜豆和蕎麥的胚并獲得了植株[13-14]。較為系統(tǒng)的胚挽救技術(shù)開始于20 世紀(jì)初，目前胚挽救技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于小麥[15]、大麥[16-17]、水稻[18]、茄子[19]、油菜[20]、百合[21]、以及眾多果樹如桃[22]、葡萄[23-24]、櫻桃[25]、蘋果[26]、柿[27]、李[28]、柑橘[29-30]等。Sirkka等最早進(jìn)行小黑麥胚挽救技術(shù)研究[31]。目前國內(nèi)外對(duì)小黑麥劣變種子胚挽救技術(shù)研究較少。為提高劣變種子的利用率和挽救種質(zhì)資源，試驗(yàn)以10份澳大利亞小黑麥品種的劣變種子為試材，在體外進(jìn)行胚培養(yǎng)，以比較各品種的胚發(fā)育率、胚萌發(fā)率和成苗率，為小黑麥種質(zhì)資源挽救提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為引自澳大利亞10個(gè)小黑麥品種(Cherokee，While M96-3182-1，33rd ITSN，DH265，AT315，Rhino，AT574，AT528，32rd ITSN，2090White)的劣變程度相同的種子。對(duì)照為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院培育的小黑麥新品系C24(CK1)和C31(CK2)，在室溫條件下保存一年的種子。

1.2 培養(yǎng)基

1/2MS+2%蔗糖+0.1%麥芽糖+0.5%瓊脂， pH 5.8，于121℃高壓滅菌20 min。

1.3 種子消毒及接種

先將參試材料的種子沖洗干凈，用次氯酸鈉消毒5～10 min，再用蒸餾水沖洗干凈。將沖洗干凈的種子浸泡在蒸餾水中，放置4℃冰箱24 h。

將浸泡的種子在無菌操作臺(tái)用次氯酸鈉消毒5～10 min，無菌水沖洗干凈并用無菌濾紙將種子干燥。用鑷子將種皮剝除，然后將胚從胚和胚乳連接處切出，完整的胚盾片向上接種到培養(yǎng)基中。

1.4 培養(yǎng)及轉(zhuǎn)接

將接種好的胚放置于17℃、光照16 h、黑暗8 h的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)胚發(fā)芽至3片葉時(shí)，轉(zhuǎn)移到花盆。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將引自澳大利亞10個(gè)劣變小黑麥品種(Cherokee，While M96-3182-1，33rd ITSN，DH265，AT315，Rhino，AT574，AT528，32rd ITSN，2090White)和對(duì)照材料經(jīng)種子消毒及接種后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每天定時(shí)進(jìn)行觀察，每隔5 d統(tǒng)計(jì)小黑麥的胚發(fā)育率、成苗率，直至小黑麥的胚發(fā)育率、成苗率不在變化。

1.6 測定指標(biāo)及方法

接種的胚長出綠芽或須根時(shí)為胚發(fā)育，胚發(fā)育率為發(fā)育胚數(shù)占接種胚珠數(shù)的百分率[32]。

胚發(fā)育率(%)=胚發(fā)育數(shù)/接種胚數(shù)×100%

成苗率為正常苗數(shù)占接種胚珠數(shù)的百分率。正常苗為具有正常的根、莖和葉等器官的植株[32]。

成苗率(%)=成苗數(shù)/接種胚數(shù)×100%

1.7 數(shù)據(jù)分析

用SPSS19.0軟件中二因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)方法，分別分析不同小黑麥材料間、培養(yǎng)時(shí)間間和品種×培養(yǎng)時(shí)間交互作用間胚發(fā)育率、胚萌發(fā)率和成苗率方差的差異顯著性，進(jìn)行方差分析時(shí)將胚發(fā)育率和成苗率進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換(反正弦轉(zhuǎn)換)。如果差異顯著，用Duncan法進(jìn)行多重比較。對(duì)小黑麥的胚發(fā)育率和成苗率進(jìn)行相關(guān)性分析。用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖。

2 結(jié)果與分析

小黑麥材料間，誘導(dǎo)培養(yǎng)天數(shù)間以及小黑麥材料間×誘導(dǎo)培養(yǎng)天數(shù)交互間的胚發(fā)育率和成苗率存在極顯著差異(P<0.01)，需進(jìn)行多重比較(表1)。

2.1 胚發(fā)育率

2.1.1 小黑麥材料間胚發(fā)育率的差異 參試的12份小黑麥材料中，2個(gè)對(duì)照的胚發(fā)育率相近，顯著高于其余材料；Cherokee和DH265的胚發(fā)育率顯著高于其余參試材料；小黑麥材料2090White、AT528、While M96-3182-1、AT574和AT315的胚發(fā)育率依次降低，且有顯著差異；33rd ITSN和、32rd ITSN和Rhino的胚發(fā)育率為0(表2)。

表1 小黑麥胚發(fā)育率和出苗率的方差結(jié)果分析

注：**達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，下同

表2 小黑麥材料間胚發(fā)育率和成苗率的差異

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.1.2 培養(yǎng)天數(shù)間胚發(fā)育率的差異 由于小黑麥品種33rd ITSN、32rd ITSN和Rhino的胚發(fā)育率為0，所以從培養(yǎng)天數(shù)間胚發(fā)育率差異的影響中去除。隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，小黑麥胚的發(fā)育率逐漸增加(表3)。0～7 d時(shí)，小黑麥材料的胚發(fā)育率顯著低于其他培養(yǎng)天數(shù)；7～12 d時(shí)，胚發(fā)育率增加較快，增加率為25.4%；隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長，胚發(fā)育率增加幅度減緩，27 d和32 d時(shí)，胚發(fā)育率無顯著差異。

表3 誘導(dǎo)培養(yǎng)天數(shù)間胚發(fā)育率和成苗率的差異

2.1.3 小黑麥材料×培養(yǎng)天數(shù)交互作用間胚發(fā)育率的差異 CK1和CK2的胚發(fā)育率在誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d時(shí)已經(jīng)完全發(fā)育，顯著高于其余小黑麥材料。隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)天數(shù)增加，各參試小黑麥材料胚發(fā)育率的變化有差異，Cherokee誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的胚發(fā)育率較低，為57.65%，隨著誘導(dǎo)天數(shù)增加，胚發(fā)育率逐漸增加，27、32 d時(shí)胚發(fā)育率顯著增加；DH265誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的胚發(fā)育率較高(83.33%)，胚發(fā)育率隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加而緩慢增加，22 d時(shí)胚發(fā)育率顯著增加，27，32 d時(shí)胚發(fā)育率還在增加，但無顯著差異；2090White誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d時(shí)，胚發(fā)育率較低(31.18%)，12、17、22 d時(shí)胚發(fā)育率增加速度較快，差異顯著(P<0.05)，27、32 d的增加緩慢，無顯著差異(P>0.05)；AT528的胚發(fā)育率在誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d時(shí)胚發(fā)育率為56.67%，12 d時(shí)胚發(fā)育率顯著增加，誘導(dǎo)培養(yǎng)12、17、22、27 d胚發(fā)育率增加緩慢，無顯著差異。AT315在誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d時(shí)，胚發(fā)育率較低(5%)，12，17 d胚發(fā)育率顯著增加，17 d較12 d高118.95%，27，32 d胚發(fā)育率顯著增加；While M96-3182-1誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d時(shí)胚發(fā)育為11.76%，12、17、22、27 d胚發(fā)育率增加，均差異顯著，27 d和35 d胚發(fā)育率無顯著差異。AT574誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d時(shí)胚發(fā)育率為0，誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d胚發(fā)育率為25.56%，誘導(dǎo)培養(yǎng)17，22和27 d胚發(fā)育率顯著增加，誘導(dǎo)培養(yǎng)35 d胚發(fā)育率增加緩慢，無顯著差異(圖1)。

圖1 小黑麥材料×培養(yǎng)天數(shù)交互作用下的胚發(fā)育率Fig.1 Triticale materials×days of inducting culture of difference embryo development rate between interaction注：柱形圖間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.2 成苗率

2.2.1 小黑麥材料間成苗率的差異 對(duì)照材料的成苗率顯著(P<0.05)高于其余材料。參試小黑麥材料劣變種子的成苗率為8.23%～57.16%，Cherokee的成苗率最高,為57.16%，顯著高于其余參試小黑麥材料；DH265次之，其成苗率顯著高于除CK1、CK2和Cherokee之外的其他材料；2090White和AT528的胚成苗率相近，居第3位；其余材料的胚成苗率較低(表2)。

2.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)天數(shù)間成苗率的差異 誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d時(shí)，小黑麥材料的成苗率為0。隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)天數(shù)增加，成苗率逐漸增加，除27 d和32 d間小黑麥材料的成苗率無顯著差異外，其余天數(shù)間的胚成苗率均有顯著差異(P<0.05)。誘導(dǎo)培養(yǎng)17 d時(shí)，小黑麥成苗率比12 d高67.18%，22 d的成苗率比17 d高18.90%，27 d的成苗率比22 d高7.65%；誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間27 d后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，成苗率增加緩慢(表3)。

2.2.3 小黑麥材料×培養(yǎng)天數(shù)交互作用間成苗率的差異 CK1和CK2在誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d時(shí)已經(jīng)全部成苗，其成苗率顯著(P<0.05)高于其余小黑麥材料。參試的小黑麥材料在誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d時(shí)成苗率均為0。Cherokee誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d時(shí)成苗率較低(6.47%)，誘導(dǎo)培養(yǎng)17 d時(shí)成苗率顯著增加，但誘導(dǎo)培養(yǎng)22，27和32 d增加緩慢，差異不顯著；DH265在誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d時(shí)成苗率為0，誘導(dǎo)培養(yǎng)17、22 d成苗率顯著增加，27、35 d成苗率增加緩慢，無顯著差異；2090White的成苗率在誘導(dǎo)培養(yǎng)12，17和22 d成苗率顯著增加，27、35 d成苗率增加緩慢，差異不顯著；AT528誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d的成苗率較高(40.67%)，17 d成苗率顯著增加，22，27和35 d的成苗率增加緩慢，差異不顯著；AT315在誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d時(shí)成苗率為0，17、22 d成苗率顯著增加，27、35 d成苗率無差異顯著性；While M96-3182-1誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d時(shí)成苗率為6.62%，誘導(dǎo)培養(yǎng)17 d成苗率顯著增加，高于241.24%，22 d時(shí)成苗率顯著增加，27、35 d成苗率增加差異不顯著；AT574誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d、17 d成苗率為0，誘導(dǎo)培養(yǎng)22，27和35 d成苗率增加，但無差異顯著(圖2)。

圖2 小黑麥材料×培養(yǎng)天數(shù)交互作用的成苗率Fig.2 Triticale materials×days of inducting culture of difference seedling rate among interaction

2.3 胚發(fā)育率和成苗率的相關(guān)性分析

小黑麥材料的胚發(fā)育率和成苗率相關(guān)性分析(表4)表明，小黑麥的胚發(fā)育率和成苗率呈極顯著正相關(guān)(R=0.97)。

表4 胚發(fā)育率和成苗率的相關(guān)性分析

2.4 再生苗移栽的幼苗成活率、株高和葉片數(shù)

對(duì)照CK1和CK2的成活率最高，顯著高于其他參試小黑麥材料。劣變的種子胚成活率為9.55%～69.42%，且不同品種差異顯著，其中Cherokee成活率最高，其次為DH265，AT315的成活率最低(表5)。

對(duì)照CK1和CK2的平均株高最高，顯著高于其余參試小黑麥材料。AT528平均株高較高，為16.40 cm，和CK2無顯著差異，其次為Cherokee，While和M96-3182-1，AT574的平均株高最低。

小黑麥品種AT528的平均葉片數(shù)最高，顯著高于其余參試小黑麥材料；其次為CK1、Cherokee和AT315，3品種的平均葉片數(shù)無顯著差異；AT574的平均葉片數(shù)最少，除與2090White無顯著差異外，顯著低于其余參試小黑麥。

3 討論

貯藏時(shí)間對(duì)種子的萌發(fā)具有較大的影響。張東暉等[33]研究表明，隨貯藏時(shí)間延長，種子劣變加劇，但有一定的安全貯藏期。貯藏14年喪失活力，貯藏7～8年失去種用價(jià)值，貯藏6年活力驟然下降，不宜作為播種用，貯藏4年保持較高的活力，適當(dāng)可作播種用，也可作為種質(zhì)資源保存期延長至6年，貯藏2～3年活力表現(xiàn)最強(qiáng)，說明其種用價(jià)值最佳。試驗(yàn)選用不同程度劣變種子進(jìn)行研究，表明正常的種子胚的發(fā)育率和成苗率較高，并且由于劣變種子的劣變程度不同，其發(fā)育率和成苗率各異，發(fā)育率由高到低依次為：CK2>CK1>DH265>Cherokee>2090White>AT528>WhileM96-3182-1> AT754>AT315，成苗率依次為：CK2>CK1>Cherokee>DH265>2090White>AT528>WhileM96-3182-1> AT754>AT315。從而說明DH265和Cherokee的劣變程度較輕，2090White和AT528居中，其余3個(gè)材料種子的劣變程度較重，而33rd ITSN，32rd ITSN和Rhino小黑麥種子已經(jīng)喪失了活力。和張東暉等[33]的研究結(jié)果類似。不同植物種類或品種胚培養(yǎng)存在較大差異。傅雪琳等[34]研究發(fā)現(xiàn)，成熟稻材料間胚愈傷組織誘導(dǎo)率、質(zhì)地結(jié)構(gòu)和綠苗再生率有顯著差異。王丹菲等[35]用不同百合品種雜交獲得的幼胚為外植體，進(jìn)行離體胚培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，不同雜交組合的胚發(fā)育率差異較大。試驗(yàn)材料DH265和Cherokee的劣變程度較輕，但2個(gè)材料間的胚發(fā)育率和成苗率還有顯著差異。由于成苗率和胚發(fā)育率極顯著正相關(guān)，所以對(duì)其差異原因沒有單獨(dú)列出。

胚培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胚挽救具有重要作用，張?jiān)虑俚萚36]研究表明，小麥成熟胚培養(yǎng)12 d就可以達(dá)到理想的分化效果，唐冬梅等[37]研究表明，無核葡萄不同基因型的胚培養(yǎng)時(shí)間不同。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著誘導(dǎo)天數(shù)增加，參試小黑麥材料的胚發(fā)育率逐漸增加。誘導(dǎo)培養(yǎng)7～12 d時(shí)胚發(fā)育率和成苗率增加幅度較大，誘導(dǎo)培養(yǎng)27 d和32 d時(shí)小黑麥材料的胚發(fā)育率和成苗率無顯著差異，說明小黑麥胚培養(yǎng)的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為27 d。

由小黑麥材料×誘導(dǎo)培養(yǎng)天數(shù)間的胚發(fā)育率和成苗率差異可知，CK1和CK2的胚發(fā)育率和成苗率在誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d時(shí)，均達(dá)100%，但劣變小黑麥材料種子在誘導(dǎo)培養(yǎng)27 d時(shí)，胚發(fā)育率仍沒有達(dá)到100%，表明種子劣變對(duì)胚萌發(fā)有很大影響。參試的每種小黑麥材料的胚發(fā)育率和成苗率隨著時(shí)間的增加而增加，但增加的速度不同。材料Cherokee的胚發(fā)育率在7～12 d時(shí)增加較快，而2090White在17～22 d增加快，AT315和WhileM96-3182-1隨著時(shí)間的增加呈階梯式增加，其余材料的胚發(fā)育率顯著增加，但幅度不大。小黑麥材料2090White和AT528的成苗率在7-12 d時(shí)增加幅度較大，Cherokee和DH265在12-17d時(shí)增加快，其余材料增加勻速增加。趙占軍等[38]研究胚齡對(duì)小麥幼胚組織培養(yǎng)效果中表明，幼胚組織培養(yǎng)最適宜的胚齡為14～16 d。孫蘇陽等[39]研究表明，小麥胚齡為16 d 時(shí)，其萌發(fā)率和成苗率較高，是較為合適的幼胚培養(yǎng)時(shí)期。材料33rd ITSN，32rd ITSN，Rhino隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的增加而無變化，可能由于其種子劣變時(shí)間較長，而失去活力。

4 結(jié)論

小黑麥材料間胚發(fā)育率由高到低依次為：CK2>CK1>DH265>Cherokee>2090White>AT528> WhileM96-3182-1>AT754>AT315，成苗率的順序?yàn)椋篊K2>CK1>Cherokee>DH265>2090White>AT528> WhileM96-3182-1>AT754>AT315；小黑麥品種33rd ITSN、32rd ITSN和Rhino的胚發(fā)育率和成苗率均為0，完全失活；對(duì)劣變小黑麥的種子沒喪失活力的胚進(jìn)行培養(yǎng)，最適宜的時(shí)間為27 d。

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