薛宏坤，徐 浩，朱廣浩，鄭先哲

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 工程學(xué)院，哈爾濱 150030)

0 引言

藍(lán)莓中富含豐富的花青素、維生素C和維生素E[1-2]，這些活性成分具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，有益于人體健康。其中，花青素具有抗氧化、清除人體自由基、抗炎、保護(hù)心腦血管和緩解視疲勞等功效[3-4]，在食品、保健品、藥品和化妝品等行業(yè)中有著巨大的應(yīng)用潛力[5]。由于花青素屬于熱敏性成分，對高溫、光、氧氣等外界條件有很強(qiáng)的敏感性[6]。

如何從藍(lán)莓中獲取高得率、低降解率的花青素成為科研工作者研究的熱點(diǎn)話題。造成花青素降解的因素有內(nèi)因和外因：內(nèi)因是花青素自身結(jié)構(gòu)，由于花青素具有多個(gè)酚羥基，根據(jù)取代基的不同，穩(wěn)定性差異較大，甲基化能增加花青素的穩(wěn)定性，羥基化使花青素穩(wěn)定性降低[7]；外因國內(nèi)外學(xué)者也進(jìn)行了相關(guān)研究。王芳等[8]研究了溫度對藍(lán)莓活性成分影響，表明高溫可加快活性成分降解；Chan[9]等研究微波輔助萃取植物中的花青素，表明微波輻射使萃取體系極性分子吸收微波能，溫度升高，高溫加速花青素降解；Reyes等[10]研究不同pH下花青素降解特性，研究發(fā)現(xiàn)pH越高花青素降解速率越快；Ochoa等[11]研究光照對花青素降解速率的影響，表明在光照下花青素的降解明顯高于避光條件；Chung等[12]研究金屬離子對花青素降解的影響，研究發(fā)現(xiàn)Fe3+、Cu2+加速花青素降解；Dorota等[13]研究向花青素中通入氧氣，發(fā)現(xiàn)隨通氧量增加，花青素降解速率增加；Veridiana等[14]研究在櫻桃中加入適量的Vc能顯著降低花青素降解速率。以上學(xué)者僅對影響花青素降解的因素進(jìn)行研究，但微波輔助萃取工藝對花青素降解影響尚未見報(bào)道。

本文研究主要內(nèi)容：通過單因素試驗(yàn)，考查微波強(qiáng)度、萃取時(shí)間、乙醇濃度、料液比對花青素降解規(guī)律的影響；以花青素降解率最低為目標(biāo)，通過二次正交旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)來優(yōu)化合理的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

挑選成熟度均一、籽粒飽滿的藍(lán)莓置于冰箱中冷凍，在試驗(yàn)前從冰箱中取出，解凍3h，然后放在九陽打漿機(jī)中進(jìn)行打漿；將果漿置于玻璃皿中，放在冰箱中冷凍12h后，置于TD-50凍干機(jī)(上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司)凍至24h，用植物性粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過40目篩，制成果粉，避光密封保存與冰箱中備用。

試劑：香草醛、濃鹽酸、甲醇、無水乙醇均為分析純，購自于天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 萃取過程

1)萃取體系的構(gòu)建：用AB204-S型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)準(zhǔn)確稱取2.000 0(±0.000 5)g藍(lán)莓粉置于萃取容器中，加入試驗(yàn)預(yù)先確定體積和濃度的乙醇作為萃取劑來構(gòu)建萃取體系。

2)微波萃取過程：將萃取容器置于微波工作站(MWS,加拿大FIOS公司)的中央，連接溫度和壓力光纖傳感器，將傳感器的探頭置于萃取體系內(nèi)，利用FIOS軟件實(shí)時(shí)測定萃取液內(nèi)部溫度和壓力的變化。

3)萃取體系渣液分離：經(jīng)微波處理后萃取體系倒入離心管中，置于LG10-2.4A(北京京立離心機(jī)有限公司)離心機(jī)中以4 000r/min、15min離心，其目的將上清液和殘?jiān)蛛x，用一定濃度乙醇洗滌殘?jiān)?，直到殘?jiān)鼰o色為止；收集多次洗滌的渣液置于100mL容量瓶中，用一定濃度的乙醇定容至刻度得到渣液備用；將上清液用一定濃度乙醇定容100mL容量瓶中得到原液備用。

4)顯色液制備：A液取1.000g香草醛置于100mL容量瓶中，用甲醇定容到100mL混均；B液取8 mL的濃鹽酸置于100mL容量瓶中，用甲醇定容到100mL混均。將A液與B液1∶1混合制得顯色液。

1.2.2 花青素萃取率測定

采用低濃度香草醛-鹽酸法[15]測定藍(lán)莓中花青素萃取率和降解率。方法如下：用移液槍準(zhǔn)確移取1.0mL原液置于10mL比色管中，用一定濃度的乙醇將原液稀釋10倍；然后從稀釋的原液中取出2 mL置于另一個(gè)10mL比色管中，加入10mL顯色液，混勻后置于30℃DK-98-IIA型恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)中，30min(避光)。用LAMBDA35型紫外-可見分光光度計(jì)(美國Perkin Elmer公司)在500nm處測定原液的OD值，利用標(biāo)準(zhǔn)方程y=1.612x-0.048 5[16](決定系數(shù)R2=0.998 9)計(jì)算出藍(lán)莓中的花青素的濃度值，最后通過花青素萃取率的計(jì)算公式計(jì)算出花青素萃取率，其公式為

(1)

其中，D為花青素萃取率(%)；C為花青素濃度(mg/mL)；V為定容體積(mL)；n為稀釋倍數(shù)；W為花青素總量(mg)。本研究中新鮮藍(lán)莓中100g果粉花青素總含量為101.17mg。

1.2.3 花青素降解率測定

用移液槍準(zhǔn)確移取2 mL的渣液置于10 mL的比色管中，加入10 mL的顯色液，以下的操作步驟同原液OD值測定方法相同。使用上述方法測定渣液中花青素含量，即為花青素殘留率，通過式(2)[17]，可計(jì)算得到微波輔助萃取過程中花青素的降解率，即

Y降解率=1-Y萃取率-Y殘留率

(2)

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用微波強(qiáng)度(W/g)、萃取時(shí)間(s)、乙醇濃度(%)、料液比 (g/mL)作為試驗(yàn)因素，以藍(lán)莓中花青素降解率為試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1所示。

表1 單因素試驗(yàn)的因素和水平

1)單因素試驗(yàn)。以藍(lán)莓為原料，選取微波強(qiáng)度(50～250W/g)，萃取時(shí)間(0～100s)，乙醇濃度(20%～80%)，料液比(1∶10～1∶50)作為試驗(yàn)因素，以花青素降解率為目標(biāo)因素。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，并對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2)組合試驗(yàn)。選用微波強(qiáng)度、萃取時(shí)間、乙醇濃度、料液比作為中心組合試驗(yàn)的影響因素，采用響應(yīng)曲面法(RSM)建立試驗(yàn)參數(shù)的回歸模型，研究試驗(yàn)因素對花青素降解率的影響。各因素的取值范圍如表2所示。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼表

利用Design-Expert ver6.0(SAT-EASE, Inc., Last September,UK)對試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并對所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用響應(yīng)面分析法得到二次回歸模型為

(3)

其中，b0為截距回歸系數(shù)；bi為線性回歸系數(shù)；bii為交互項(xiàng)的回歸系數(shù)；Xi、Xj為自變量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別采用SigmaPlot12.5(SPSS, Inc., Chicago, US)軟件進(jìn)行作圖和DesignExpert ver6.0(SAT-EASE, Inc., Last September,UK)軟件，構(gòu)建響應(yīng)曲面模型，研究因素之間的交互影響及對藍(lán)莓花青素的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證，確定本研究的可靠性。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波強(qiáng)度對花青素降解率的影響

選取萃取時(shí)間為50s，乙醇濃度50%，料液比為1∶30，考查不同微波強(qiáng)度對花青素降解率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同微波強(qiáng)度對花青素降解率的影響

由圖1可知：隨著微波強(qiáng)度的增加，藍(lán)莓中花青素降解率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。當(dāng)微波強(qiáng)度在150W/g時(shí)，花青素降解率達(dá)到最小值5.66%；當(dāng)微波強(qiáng)度在50～150W/g范圍內(nèi)，隨著微波強(qiáng)度的增加，花青素降解率降低；當(dāng)微波強(qiáng)度在150～250W/g范圍內(nèi)，隨著微波強(qiáng)度的增加，降解率增加。其原因是隨著微波強(qiáng)度的進(jìn)一步增加，萃取液溫度迅速增加，花青素是熱敏性物質(zhì)，當(dāng)萃取液溫度到50℃時(shí)，花青素結(jié)構(gòu)被破壞，50%以上的花青素發(fā)生降解[18]；微波強(qiáng)度在150W/g以上時(shí)，萃取液的溫度均大于50℃，從而使花青素降解率增加。

2.2 萃取過程對花青素降解率的影響

選取微波強(qiáng)度為150W/g，乙醇濃度為50%，料液比為1∶30，考查不同萃取時(shí)間對花青素降解率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：隨著萃取時(shí)間的延長，藍(lán)莓中花青素降解率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。當(dāng)微波萃取時(shí)間在50s時(shí)，降解率達(dá)到最小值5.57%。當(dāng)萃取時(shí)間在0～50s范圍內(nèi)，降解率隨萃取時(shí)間的增加而降低，原因是此時(shí)花青素萃取率隨時(shí)間的延長而增加，故花青素降解率降低；隨著萃取時(shí)間的延長，花青素降解率增加。由于隨著微波輻射時(shí)間的延長，熱積累效應(yīng)增強(qiáng)，溫度迅速升高。有微波萃取條件下花青素降解規(guī)律和阿倫尼烏斯方程可以導(dǎo)出，花青素降解量與萃取體系溫度的關(guān)系方程，其方程[19]為

(4)

由式(4)可知：溫度越高，花青素降解量越大，故花青素降解率增加。

圖2 不同萃取時(shí)間對花青素降解率的影響

2.3 乙醇濃度對花青素降解率的影響

選取微波強(qiáng)度為150W/g、萃取時(shí)間為50s、料液比為1∶30，考查不同乙醇濃度對花青素降解率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同乙醇濃度對花青素萃取率和降解率的影響

由圖3可知：當(dāng)乙醇濃度在50%時(shí)，花青素萃降解率達(dá)到最小值7.96%；當(dāng)乙醇濃度在20%～50%范圍內(nèi)，花青素降解率隨乙醇濃度的升高而降低。當(dāng)乙醇濃度在50%時(shí)，乙醇極性與花青素極性相似，根據(jù)相似相容原理，故此時(shí)花青素萃取率最高[16]，降解率最低；當(dāng)乙醇濃度進(jìn)一步增加，高濃度乙醇破壞花青素-蛋白質(zhì)和花青素-纖維素之前的氫鍵和疏水鍵[20]，造成花青素結(jié)構(gòu)被破壞，故花青素降解率增大。

2.4 料液比對花青素降解率的影響

選取微波強(qiáng)度為150W/g、萃取時(shí)間為50s、乙醇濃度50%考查不同料液比對花青素萃降解率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同料液比對花青素萃取率和降解率的影響

由圖4可知：當(dāng)料液比在1∶30時(shí)，花青素降解率達(dá)到最小值3.79%；當(dāng)料液比在1∶10～1∶30范圍內(nèi)，花青素的降解率隨料液比的升高而降低；當(dāng)料液比在1∶30～1∶50時(shí)，花青素降解率隨料液比的增加而增加。一方面由于固體內(nèi)部存在傳質(zhì)極限，因此當(dāng)溶劑量增大時(shí)，驅(qū)動(dòng)力不再增大[21]，溶劑吸收消耗微波能，使得進(jìn)入藍(lán)莓顆粒內(nèi)的微波能少，細(xì)胞壁破壞能力減弱，花青素萃取率降低，降解量增加；另一方面由于料液比的增加，加快了其它雜質(zhì)的溶出，溶出的雜質(zhì)加速花青素降解，因此花青素降解率增加。

3 花青素的降解工藝優(yōu)化

3.1 微波輔助萃取參數(shù)交互作用分析

按照表3中試驗(yàn)的設(shè)計(jì)編碼條件進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，以花青素降解率為試驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

表3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

續(xù)表3

表3中，X1為微波強(qiáng)度(W/g)；X2為萃取時(shí)間(s)；X3為乙醇濃度(%)；X4為料液比(g/mL)。

3.1.1 花青素降解率的方差分析和回歸方程

由方差分析可知，該模型極顯著(p<0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05)。決定系數(shù)R2=0.923 5，說明92.35%的響應(yīng)值變化能夠用該模型解釋。由方差分析表中各因素的F值大小可知：在花青素萃取率的回歸模型中，X1、X4、X12、X42項(xiàng)極顯著，X2、X3、X1X4、X2X3項(xiàng)顯著。試驗(yàn)選取的各因素對藍(lán)莓花青素降解率的影響程度大小順序依次為微波強(qiáng)度>料液比>萃取時(shí)間>乙醇濃度。剔除模型中不顯著項(xiàng)，得到藍(lán)莓花青素降解率的回歸方程，即

(5)

其中，X1為微波強(qiáng)度(W/g)；X2為萃取時(shí)間(s)；X3為乙醇濃度(%)；X4為料液比(g/mL)；Y為藍(lán)莓花青素萃取率(%)。

3.1.2微波強(qiáng)度和料液比對花青素降解率交互影響

當(dāng)萃取時(shí)間和乙醇濃度在50s和50%水平時(shí)，考察料液比和微波強(qiáng)度對藍(lán)莓花青素降解率的交互影響，如圖5所示。

圖5 微波強(qiáng)度和料液比對花青素降解率的影響

當(dāng)料液比在某一水平時(shí)，隨微波強(qiáng)度的增加，花青素降解率呈現(xiàn)先減小后升高的趨勢。其原因同單因素2.1。 當(dāng)微波強(qiáng)度一定時(shí)，花青素降解率隨料液比的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，其原因是隨料液比的增加，花青素萃取率增加，因此花青素降解率降低。當(dāng)料液比較高時(shí)，其他極性醇溶性成分溶解，抑制花青素溶解，花青素萃取率下降，故花青素降解率增加。當(dāng)料液比在1∶30和微波強(qiáng)度在150W/g時(shí)，花青素萃取率最低7.23%。

3.1.3萃取時(shí)間和乙醇濃度對花青素降解率的交互影響

當(dāng)微波強(qiáng)度和料液比在150W/g和1∶30水平時(shí)，考察萃取時(shí)間和乙醇濃度對藍(lán)莓花青素降解率的交互影響，如圖6所示。

圖6 萃取時(shí)間和乙醇濃度對花青素降解率的影響

由圖6可知：乙醇濃度和萃取時(shí)間顯著影響花青素降解率。乙醇濃度在某一水平時(shí)，花青素降解率隨萃取過程呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。由于花青素降解符合一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型[22]，即

C=C0·exp(-kt)

(6)

其中，k為反應(yīng)速率常數(shù)。微波處理過程中溫度對k的影響采用Arrhenius經(jīng)驗(yàn)方程[23]，即

(7)

由式(6)、式(7)可知：隨著萃取時(shí)間的延長，萃取液的溫度升高，反應(yīng)速率常數(shù)k增大，故花青素降解率增加。當(dāng)萃取時(shí)間一定時(shí)，花青素降解率隨乙醇濃度的增加而增加。其原因是隨乙醇濃度的增加，萃取體系蒸餾水含量減少，其沸點(diǎn)低于蒸餾水，因此高濃度的乙醇更易吸收微波能，使萃取體系溫度升高，高溫加速花青素降解，故花青素降解率隨乙醇濃度的增加而增加。

3.2 最優(yōu)工藝參數(shù)優(yōu)化

在建立藍(lán)莓花青素微波強(qiáng)度、萃取時(shí)間、乙醇濃度、料液比的回歸模型的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Response Surface/Central Composite Design)對萃取藍(lán)莓花青素的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選組合，優(yōu)化后的工藝參數(shù)和最優(yōu)結(jié)果如表4所示。

表4 優(yōu)化結(jié)果和驗(yàn)證值

以花青素降解率最低作為目標(biāo)，所得的最優(yōu)工藝參數(shù)為：微波強(qiáng)度為150W/g、萃取時(shí)間為50s、乙醇濃度為50%、料液比為1∶30。在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過3次試驗(yàn)確定的最優(yōu)結(jié)果為8.36%，而回歸模型的預(yù)測值為8.13%。試驗(yàn)值與預(yù)測值相對誤差為0.23%，表明了優(yōu)化結(jié)果的合理性，并進(jìn)一步驗(yàn)證了回歸模型的適用性。

4 結(jié)論

藍(lán)莓中花青素降解率隨微波強(qiáng)度、萃取時(shí)間、乙醇濃度、料液比的增加均呈現(xiàn)先減小后升高的趨勢。通過中心組合試驗(yàn)，以花青素降解率最低為目標(biāo)，確定了最優(yōu)的工藝參數(shù)組合為：微波強(qiáng)度為150W/g、萃取時(shí)間為50s、乙醇濃度為50%、料液比為1∶30，在此條件下花青素降解率為8.36%。本研究結(jié)果可為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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