武迎磊 趙 天 李 明

（1.河北省邢臺(tái)市第三醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054000；2.河北省滄州市食品藥品檢驗(yàn)所，河北 滄州061000）

動(dòng)脈粥樣硬化是多種心腦血管系統(tǒng)疾病的病理基礎(chǔ)，其中氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)是其重要的病理機(jī)制［1-2］。燈盞花素是一種具有抗炎、抗氧化、改善血液循環(huán)等多種生物學(xué)活性的黃酮類化合物［3-5］，但燈盞花素是否能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到一定的改善作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型并同步給予燈盞花素進(jìn)行干預(yù)治療，研究燈盞花素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響并初步探討其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用SD大鼠（清潔級(jí)，雄性，鼠齡6周齡，體質(zhì)量180~220 g）購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 藥物與試劑 燈盞花素片購(gòu)自廣州彼迪藥業(yè)有限公司（規(guī)格：20 mg/片，生產(chǎn)批號(hào)：20150917）；辛伐他汀片（SV）購(gòu)自北京萬(wàn)生藥業(yè)有限責(zé)任公司；氧化應(yīng)激監(jiān)測(cè)指標(biāo)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；H&E試劑盒及炎癥細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博奧森科技有限公司。

1.3 模型制備 參照周永剛等［6］報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法制備動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型：除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均通過(guò)喂養(yǎng)高脂飼料（3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料）結(jié)合腹腔注射維生素D3［給予飼料前一次性腹腔注射維生素D3（60萬(wàn)U/kg）］的方法建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，共12周。主動(dòng)脈大體解剖狀況見圖1。

1.4 分組與給藥 選取80只模型大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、 燈盞花素 6、12、24 mg/（kg·d）組和辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組，各組均 16 只，造模過(guò)程中各治療組同步灌胃給藥12周；另取同齡SD大鼠16只設(shè)為正常對(duì)照組，同步給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）HE染色法觀察主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)改變并進(jìn)行病變分級(jí)。麻醉后剝?nèi)∪L(zhǎng)主動(dòng)脈，經(jīng)4%多聚甲醛液中固定、脫水、石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色后，通過(guò)顯微鏡觀察主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；主動(dòng)脈病變標(biāo)準(zhǔn)［7］為0級(jí)：結(jié)構(gòu)正常；1級(jí)：內(nèi)膜有少量泡沫細(xì)胞積聚，無(wú)明顯的凸起斑塊；2級(jí)：內(nèi)膜可見大量泡沫細(xì)胞積聚，有明顯的粥樣斑塊，部分斑塊融合成片；3級(jí)：內(nèi)膜表面幾乎全被粥樣斑塊覆蓋，斑塊內(nèi)可見組織壞死、鈣化，斑塊底部肌層萎縮變薄。2）比色法測(cè)定血清中抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）、活性氧簇（ROS）含量。腹主動(dòng)脈取血并離心取血清，采用比色法，通過(guò)紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定各組大鼠血清中抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）、過(guò)氧化氫酶（CAT）］活性和 MDA、ROS 含量。 3）血漿中炎癥細(xì)胞因子含量測(cè)定。經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行處理，采用比色法，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定各組大鼠血漿中炎癥細(xì)胞因子 ［C反應(yīng)蛋白（CRP）、 腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、 白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）］含量水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，主動(dòng)脈病變分級(jí)采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 造模過(guò)程大鼠生存狀態(tài)及主動(dòng)脈狀況 見圖1。正常組大鼠生存狀態(tài)良好、主動(dòng)脈未見異常；而模型組大鼠呈現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)脫落等狀態(tài)，主動(dòng)脈呈現(xiàn)血管萎縮、血管壁增厚、多處鈣化等病理狀態(tài)。

圖1 主動(dòng)脈大體解剖圖片

2.2 各組大鼠主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及病變分級(jí) 見圖2，表1。正常對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈組織及細(xì)胞均未見異常，而模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞明顯受損、出現(xiàn)慢性炎癥病變、泡沫細(xì)胞形成并伴有粥樣硬化斑塊等明顯的病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。與模型組比較發(fā)現(xiàn)，燈盞花素 6、12、24 mg/（kg·d）組和辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）大鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變程度呈不同程度減輕，以燈盞花素24 mg/（kg·d）組效果最為顯著。評(píng)價(jià)主動(dòng)脈病變分級(jí)：模型組大鼠主動(dòng)脈病變2級(jí)及以上共14例（87.50%），其病變分級(jí)較正常對(duì)照組顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，燈盞花素 6、12 mg/（kg·d）組主動(dòng)脈病變分級(jí)較模型組無(wú)顯著差異（P＞0.05），燈盞花素 24 mg/（kg·d）組和辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組主動(dòng)脈病變分級(jí)顯著降低 （P＜0.01）；與辛伐他汀1.8 mg/（kg·d）組比較，燈盞花素 24 mg/（kg·d）組主動(dòng)脈病變分級(jí)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)變化（HE染色，400倍）

表1 各組大鼠主動(dòng)脈病變分級(jí)結(jié)果比較

2.3 各組大鼠血清抗氧化酶活性水平比較 見表2。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，燈盞花素 12、24 mg/（kg·d）組大鼠血清 SOD、CAT 活性（P＜0.05 或 P＜0.01）顯著升高，燈盞花素 24 mg/（kg·d）組GSH-Px活性顯著升高（P＜0.05）；燈盞花素6 mg/（kg·d）組和辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組 SOD、GSH-Px、CAT活性與模型組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組比較，燈盞花素 24 mg/（kg·d）組SOD、CAT 活性顯著升高（P＜0.05或 P＜0.01），GSH-Px活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清中抗氧化酶活性水平比較（U/mL，±s）

表2 各組大鼠血清中抗氧化酶活性水平比較（U/mL，±s）

組別 n C A T正常對(duì)照組 1 6 1 4.8 2±1.8 8模型組 1 6 8.6 5±1.4 9**燈盞花素 6 m g/（k g·d）組 1 6 9.3 7±1.7 6 S O D G S H-P x 4 2 1.6 9±3 4.2 1 9 2 8.5 3±5 7.5 8 2 5 1.3 0±2 6.0 3** 6 7 9.0 4±4 5.1 7**2 7 3.8 6±2 7.6 2 7 4 1.2 9±5 1.9 8燈盞花素 1 2 m g/（k g·d）組 1 6 1 1.9 2±2.1 7**3 1 8.5 1±3 0.7 5** 7 7 3.8 4±5 9.1 3燈盞花素 2 4 m g/（k g·d）組 1 6 3 6 1.4 3±3 4.6 8△△▲ 8 1 5.3 0±5 7.4 0△ 1 3.0 2±2.3 4△▲▲辛伐他汀 1.8 m g/（k g·d）組 1 6 2 8 3.0 6±3 1.2 2 7 6 3.4 8±4 9.1 5 9.8 2±1.7 3

2.4 各組大鼠血清MDA、ROS含量比較 見表3。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清MDA、ROS含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組，燈盞花素 12、24 mg/（kg·d）組和辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組大鼠血清 MDA、ROS含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），燈盞花素 6 mg/（kg·d）組MDA、ROS含量較模型組無(wú)顯著差異 （P＞0.05）；與辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組比較，燈盞花素 24 mg/（kg·d）組 MDA 含量顯著降低（P＜0.05），ROS 含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠大鼠血清MDA、ROS含量比較（±s）

表3 各組大鼠大鼠血清MDA、ROS含量比較（±s）

組 別 n正常對(duì)照組 1 6模型組 1 6燈盞花素 6 m g/（k g·d）組 1 6 M D A（m m o l/L） R O S（U/m L）9.5 7±0.9 2 2 0 7.4 2±2 1.9 4 4 8.0 6±6.1 8** 3 8 6.3 4±3 5.1 5**4 3.7 1±5.5 2 3 5 1.9 0±3 2.9 8燈盞花素 1 2 m g/（k g·d）組 1 6 2 9.7 6±4.6 1△△ 2 8 4.7 1±2 8.3 7△燈盞花素 2 4 m g/（k g·d）組 1 6 2 5.1 3±4.1 7△△▲ 2 4 0.0 8±2 1.9 2△△辛伐他汀 1.8 m g/（k g·d）組 1 6 3 4.6 2±4.8 4△ 2 8 7.5 4±3 0.7 8△

2.5 各組大鼠血漿中炎癥細(xì)胞因子含量比較 見表4~表5。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血漿中炎癥細(xì)胞因子 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6 含量顯著升高 （P＜0.01），炎癥細(xì)胞因子 IL-10含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較， 燈盞花素 12、24 mg/（kg·d） 組 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6 含量顯著降低 （P＜0.05 或 P＜0.01），燈盞花素 24 mg/（kg·d）組 IL-10 含量顯著升高（P＜0.01）；燈盞花素 6 mg/（kg·d）組 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 含量較模型組均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組 TNF-α 含量較模型組顯著降低 （P＜0.05），CRP、IL-1β、IL-6、IL-10 含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組比較，燈盞花素 24 mg/（kg·d） 組 CRP、IL-6 含量顯著降低且IL-10 顯著升高（P＜0.05），TNF-α、IL-1β 含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血漿中CRP、TNF-α含量比較（±s）

表4 各組大鼠血漿中CRP、TNF-α含量比較（±s）

組 別 n正常對(duì)照組 1 6模型組 1 6燈盞花素 6 m g/（k g·d）組 1 6 C R P（m g/L） T N F-α（μ g/L）4.6 2±1.0 8 1.5 2±0.4 1 1 8.7 5±3.9 0** 3.0 2±0.7 2**1 7.6 2±3.8 1 2.5 8±0.6 2燈盞花素 1 2 m g/（k g·d）組 1 6 1 4.0 2±3.1 6△ 2.3 3±0.7 9△燈盞花素 2 4 m g/（k g·d）組 1 6 1 1.4 9±2.5 8△△▲ 1.9 2±0.4 8△辛伐他汀 1.8 m g/（k g·d）組 1 6 1 7.2 6±4.0 3 2.0 3±0.4 1△

表5 各組大鼠血漿中 IL-1β、IL-6、IL-10 含量比較（pg/mL，±s）

表5 各組大鼠血漿中 IL-1β、IL-6、IL-10 含量比較（pg/mL，±s）

組別 n正常對(duì)照組 1 6模型組 1 6燈盞花素 6 m g/（k g·d）組 1 6 I L-6 I L-1 0 5 6.6±1 0.9 6 4.6 8±5.0 8 1 3 8.4±3 4.1** 2 5.3 4±3.7 5**1 2 7.9±3 0.8 2 7.1 3±4.2 4燈盞花素 1 2 m g/（k g·d）組 1 6 1 3 0.8±2 7.9△ 1 0 5.0±2 8.7△ 3 0.8 2±4.8 6燈盞花素 2 4 m g/（k g·d）組 1 6 1 2 3.5±2 5.3△ 8 9.1±2 4.9△△▲ 3 8.4 7±5.3 2△△▲辛伐他汀 1.8 m g/（k g·d）組 1 6 1 4 6.7±2 8.9 1 2 2.3±3 1.5 2 9.0 3±3.6 8 I L-1 β 1 0 7.5±1 7.8 1 8 0.2±3 1.9**1 6 3.6±3 2.1

3 討 論

隨著病理生理學(xué)研究的深入，有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制［8-9］。 Considine MJ 等［10］研究發(fā)現(xiàn) ROS 生成的活性氧和NO將破壞血管壁的光滑性，形成斑塊，斑塊破裂形成血栓。生理狀態(tài)下ROS的產(chǎn)生與還原清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，其中體內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT在維持ROS平衡中發(fā)揮著重要的作用［11-12］；抗氧化酶活性低下將導(dǎo)致ROS清除能力下降，進(jìn)而ROS蓄積而引發(fā)動(dòng)脈血管的過(guò)氧化損傷；此外，脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA的含量也能夠間接反映動(dòng)脈血管氧化應(yīng)激損傷程度。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)燈盞花素12~24 mg/（kg·d）干預(yù)治療能夠明顯改善動(dòng)脈粥樣硬化大鼠SOD、GSH-Px、CAT活性并降低MDA、ROS含量，提示燈盞花素具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化大鼠氧化應(yīng)激損傷的作用。并且，燈盞花素 24 mg/（kg·d）組 SOD、CAT 活性顯著高于辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d） 組且 MDA、ROS 含量顯著低于辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組（P＜0.05 或 P＜0.01），提示燈盞花素抗氧化作用優(yōu)于辛伐他汀。

炎癥反應(yīng)可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展［13］，Ovsepyan VA 等［14-15］研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病灶將促進(jìn)巨噬細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6 大量釋放、 同時(shí)抑制抑炎癥因子IL-10的分泌，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花素 24 mg/（kg·d）組 CRP、IL-6 含量顯著低于辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組，且 IL-10顯著高于辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組（P＜0.05），提示燈盞花素抑制炎癥反應(yīng)作用優(yōu)于辛伐他汀。

總之，燈盞花素能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到一定改善作用，并且燈盞花素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的改善作用優(yōu)于辛伐他汀。

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