馬薇薇，蔣春艷，崔毓桂

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，南京 210029)

細胞生物學中普遍存在Ca2+介導的胞內(nèi)信號傳導模式，由細胞內(nèi)Ca2+濃度和空間分布的變化構(gòu)成。Ca2+參與調(diào)控機體幾乎所有的生物學功能，諸如心臟和肌肉收縮、神經(jīng)信息傳遞、胚胎形成和發(fā)育、細胞增殖和凋亡、細胞能量代謝等等。但長期的細胞內(nèi)高Ca2+具有細胞毒性，可觸發(fā)細胞死亡。因此，波、尖峰或震蕩形式的鈣信號必須受到嚴密的調(diào)控。多種多樣的離子通道、離子泵以及轉(zhuǎn)運體的協(xié)同工作，形成了細胞膜內(nèi)外和細胞器內(nèi)外陡峭又嚴格受控的Ca2+濃度梯度[1]。卵母細胞成熟是細胞周期的轉(zhuǎn)化過程，受到Ca2+的嚴密調(diào)控。Ca2+促使卵母細胞從減數(shù)分裂阻滯期恢復，從而促進卵母細胞成熟。

一、細胞內(nèi)鈣的調(diào)節(jié)

細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度維持約100 nmol/L，這是胞內(nèi)鈣信號的背景基礎(chǔ)。胞外Ca2+濃度約為1～2 mmol/L，細胞內(nèi)Ca2+儲存庫(主要是內(nèi)質(zhì)網(wǎng))中的Ca2+濃度在250～600 μmol/L。鈣信號產(chǎn)生是由于細胞外Ca2+的內(nèi)流，或是細胞內(nèi)的Ca2+庫外流。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜上的通道和鈣泵相互協(xié)作，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞質(zhì)中的鈣穩(wěn)態(tài)[1]。

1.細胞膜的鈣調(diào)節(jié)：細胞膜主要的Ca2+通道包括瞬時感受器電位通道(transient receptor potential，TRP)、電壓門控鈣通道(voltage-gated calcium channel，VGCC)和庫控鈣內(nèi)流(store-operated Ca2+entry，SOCE)。它們介導細胞外Ca2+流入細胞質(zhì)，而鈉鈣交換體(Na+/Ca2+exchange，NCX)、Ca2+-ATP酶等轉(zhuǎn)運蛋白則負責將Ca2+移出細胞[2]。

TRP通道在各器官分布廣泛，對Na+、K+和Ca2+都有通透性。對Ca2+的通透性會因亞型不同而有很大差異，按照基因同源性可以分為6個家族。TRP通道可被多種因素調(diào)節(jié)，如溫度、滲透壓、pH 值、機械力、配體等[3-4]。

VGCC對腦、骨骼肌、心肌、平滑肌、內(nèi)分泌腺以及其他可興奮細胞的生理功能至關(guān)重要。這些膜蛋白將細胞膜去極化信號轉(zhuǎn)換為快速、局部的胞質(zhì)鈣濃度變化，繼而觸發(fā)分泌、收縮、遷移和基因轉(zhuǎn)錄等關(guān)鍵生物學事件[3-4]。

當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣儲量下降時，Ca2+可以從細胞外進入細胞，這一過程稱為庫控鈣內(nèi)流。它的機制主要涉及細胞膜上的鈣釋放激活的鈣通道蛋白1(ORAI1)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)。機制在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)時詳述[3-4]。

細胞質(zhì)中低濃度的Ca2+主要由Ca2+-ATP酶維持。它們迅速地將胞內(nèi)Ca2+泵回到細胞器內(nèi)(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng))，或泵出到細胞外空間。這些Ca2+-ATP酶根據(jù)其亞細胞定位，可進一步分為三個亞型：質(zhì)膜Ca2+-ATP酶(PMCA)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA)和高爾基體、高爾基體的囊泡分泌途徑Ca2+-ATP酶(SPCA)。每個亞型包含多個異構(gòu)體和剪接變異體，其表達、調(diào)節(jié)和動力學特性皆呈現(xiàn)組織特異性。因此，Ca2+-ATP酶有助于形成一個高度復雜而精細的細胞內(nèi)Ca2+信號網(wǎng)[1-2]。

2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的調(diào)節(jié)：細胞內(nèi)Ca2+高度集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，它不是簡單的儲存場所，而是一個動態(tài)的存儲場所，它通過釋放或吸收鈣來對電和化學刺激作出反應，從而有利于快速的生理性鈣信號介導。而Ca2+耗竭既是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的原因，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的結(jié)果。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要通過雷尼丁受體(RyR)和1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)釋放Ca2+[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+耗竭時，由肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP 酶(SERCA)和基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[6-7]。

RyRs是位于肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的Ca2+通道，主要在可興奮細胞中表達。在肌肉中，通過開啟肌漿網(wǎng)的RyRs，Ca2+才得以釋放。哺乳動物有三種不同亞型的RyRs，但沒有一個是完全特異性的亞型。RyR1主要表達于骨骼肌，骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)上的RyR1與細胞膜二氫吡啶受體(DHPR)分子間相互作用，當動作電位引起細胞膜去極化，DHPR的構(gòu)象變化激活RyR1 產(chǎn)生電壓依賴性鈣釋放；RyR2主要表達在心肌，心肌細胞興奮前，首先通過L型Ca2+通道使細胞外少量的Ca2+內(nèi)流，內(nèi)流的Ca2+誘導肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+通過RyR2釋放至胞漿中，此過程稱之為Ca2+誘導的鈣釋放；RyR3主要表達在大腦和橫膈，也是通過Ca2+誘導鈣釋放的方式激活[8-9]。

IP3R是一個專門的受體門控鈣通道，通過1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和鈣調(diào)節(jié)Ca2+濃度。IP3Rs主要在非興奮性細胞如血管平滑肌和呼吸平滑肌中表達。當IP3與IP3R 結(jié)合，使通道開放，將Ca2+釋放到細胞質(zhì)中，而這一過程進一步激活I(lǐng)P3敏感的鈣庫釋放Ca2+。該反應導致局部Ca2+增加，促進鈣結(jié)合在IP3R第二位點，使IP3R通道失活，終止鈣的釋放。肌漿網(wǎng)中Ca2+減少也有助于終止Ca2+的釋放[3，8]。

STIM1是肌漿網(wǎng)的膜蛋白，作為Ca2+傳感器，向質(zhì)膜Ca2+通道傳遞信息。當內(nèi)部存儲的Ca2+下降時，STIM1可形成點狀結(jié)構(gòu)聚集在肌漿網(wǎng)上，并促使肌漿網(wǎng)靠近質(zhì)膜，與細胞膜上的鈣釋放激活的ORAI1相互作用，使得Ca2+進入細胞內(nèi)[3，7]。而SERCA作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)主要的鈣泵，每水解1分子ATP，將從胞漿運輸兩個Ca2+到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，因此通過ORAI1進入細胞質(zhì)的Ca2+，被SERCA回收到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。鑒于SERCA泵對鈣代謝的重要性，它們的活動受多層次的嚴格管制，包括基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達、與內(nèi)源性蛋白的相互作用，以及各種翻譯后修飾[8]。

3.線粒體的鈣調(diào)節(jié)：線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間有緊密的物理聯(lián)系，稱作線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)。它的主要功能是調(diào)控脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和控制細胞鈣信號。為了攝取鈣，線粒體必須暴露于高鈣濃度，此過程最有可能發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近。在接觸部位，Ca2+直接從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到線粒體，控制關(guān)鍵的線粒體功能，如凋亡和生物合成。此外，線粒體對Ca2+的攝取也參與了鈣信號的轉(zhuǎn)導，并可防止細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的過度升高[10-11]。

線粒體是細胞內(nèi)的鈣緩沖區(qū)，緩沖質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+流，從而維持鈣穩(wěn)態(tài)。干擾這種鈣緩沖活動將導致胞內(nèi)鈣異常增加，可激活不同的信號通路，包括鈣和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白激酶Ⅱ型(CaMKⅡ)，導致卵母細胞周期改變。細胞質(zhì)的Ca2+可以通過線粒體外膜電壓依賴的陰離子選擇性通道(voltage dependent anion-selective channel，VDAC)，先通過線粒體外膜，再通過線粒體內(nèi)膜依賴單向吸收體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)將Ca2+轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)部。而線粒體內(nèi)累積的Ca2+最終將通過鈉鈣交換體和氫/鈣轉(zhuǎn)運蛋白移除[9，12]。

VDAC蛋白是線粒體外膜通道中最豐富的蛋白。它們調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外呼吸代謝物的運輸，并且廣泛參與調(diào)節(jié)代謝物和活性氧自由基(ROS)水平以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的信號傳導。在哺乳動物中，VDAC有三種同種型，由位于不同染色體上的不同基因編碼。進化最早的同種型是VDAC3，而VDAC1是最主要的。所有的同種型都在哺乳動物線粒體中普遍表達，但在物種間有差異，而個體的表達水平在不同組織之間也有變化。細胞VDAC位于外線粒體膜中，所有三種同種型都與線粒體結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria-associated ER-membrane，MAM)密切相關(guān)。許多蛋白質(zhì)組學研究的發(fā)現(xiàn)表明，所有的同種型都可能參與線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)。VDAC2在HL-1細胞的肌漿網(wǎng)/線粒體結(jié)上與RyR2物理相互作用，以產(chǎn)生對線粒體Ca2+攝取至關(guān)重要的Ca2+微域[9，12]。

MCU的主要成分仍然未知。作為線粒體內(nèi)膜攝入Ca2+的唯一來源，MCU對Ca2+具有低親和力。這一特性可以解釋為線粒體通常緊鄰內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)膜中IP3R或RyR Ca2+的出口處，能夠感測具有高Ca2+濃度的微區(qū)域，因而補償了MCU的低親和力。這種機制可以控制線粒體膜上的Ca2+運輸，并阻止線粒體Ca2+過載[12]。

4.細胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白：Ca2+可以直接傳遞信息，也可以結(jié)合酶位點，并升高或者降低酶的活性。但是，在大多數(shù)情況下，Ca2+并不直接傳遞信息。Ca2+信號不同的振幅、頻率和位置可編碼多種信息，這些信息可以由鈣結(jié)合蛋白破譯。鈣結(jié)合蛋白是能夠與Ca2+特異性結(jié)合的一類蛋白質(zhì)的總稱，具有EF-手的結(jié)構(gòu)特征。EF-手結(jié)構(gòu)是Ca2+結(jié)合區(qū)，每個EF-手有兩個Ca2+結(jié)構(gòu)域，可以各結(jié)合一個Ca2+。迄今為止發(fā)現(xiàn)了超過800種鈣結(jié)合蛋白，其中，有100多種蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)被揭示。然而，它們精確的功能依然未知。重要的鈣結(jié)合蛋白都是EF-手結(jié)構(gòu)蛋白，如鈣調(diào)蛋白(Calmodulin)、肌鈣蛋白C(troponin C)、恢復蛋白(recoverin)、S-100、STIM(基質(zhì)相互作用分子)，它們都結(jié)合Ca2+并傳遞信號。其他EF-手結(jié)構(gòu)蛋白，例如小清蛋白、鈣視網(wǎng)膜蛋白可以維持Ca2+的動態(tài)平衡。這些蛋白質(zhì)大多含有偶數(shù)個的(在2～12之間)EF-手結(jié)構(gòu)[13]。

在進化中，鈣調(diào)蛋白(CaM)是最為保守的EF-手結(jié)構(gòu)蛋白。它廣泛存在于所有真核生物中，且在所有脊椎動物中的編碼序列是100%相同的。在人類中，它由三個非等位基因編碼，但盡管蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相同，編碼序列卻差異很大。CaM的外形類似啞鈴，有2個相似的球形末端，中間是長的靈活的螺旋結(jié)構(gòu)，且EF-手結(jié)構(gòu)易于成對出現(xiàn)。當CaM與Ca2+結(jié)合后，CaM出現(xiàn)構(gòu)象的改變，暴露蛋白表面的疏水區(qū)，與靶蛋白親和性增強，能迅速與靶蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞功能[13-14]。

STIM是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白質(zhì)，能探測到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+的濃度。STIM的EF-手結(jié)構(gòu)是不尋常的，它由典型的和非典型的EF-手結(jié)構(gòu)組成。EF-手結(jié)構(gòu)可結(jié)合Ca2+，但非典型EF-手結(jié)構(gòu)中對Ca2+至關(guān)重要的氨基酸被替換，影響了與鈣的結(jié)合，因此在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+呈現(xiàn)高濃度時，STIM與Ca2+的親和力比CaM和其他EF-手結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)低3個數(shù)量級。當鈣庫消耗后，Ca2+又從STIM分子的EF-手結(jié)構(gòu)域中解離，STIM的構(gòu)象改變，與細胞膜上的ORAl1蛋白結(jié)合，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細胞膜之間形成連接，激活鈣通道的開放[11]。

S-100蛋白家族是也是含EF-手的蛋白質(zhì)家族，因在飽和硫酸銨溶液中可溶而得名。到現(xiàn)在，在人類已經(jīng)確定21種S-100蛋白。他們很小，通常包含兩個EF-手，在C-末端是典型的EF-手結(jié)構(gòu)，而N-末端的是一個偽EF-手結(jié)構(gòu)，其中14號殘基與Ca2+結(jié)合的親和力很低。這些蛋白質(zhì)也結(jié)合其他的二價金屬離子如鋅和銅，并且通常是以同源二聚體形式出現(xiàn)。它們調(diào)節(jié)許多細胞功能，如轉(zhuǎn)錄、細胞周期、細胞生長、運動、分化。除了金屬離子，其中一些也與目標蛋白例如細胞外的RAGE(晚期糖基化終產(chǎn)物受體)結(jié)合。目前尚不清楚它們是主動分泌還是被動釋放到細胞外。一些S-100蛋白表達的失調(diào)會導致不同的疾病表型，包括癌癥[15]。

二、Ca2+的細胞生物學作用

“第一信使”與質(zhì)膜受體的相互作用，是傳遞信息給細胞的典型方式，而隨之激活擴散的“第二信使”，又將信息傳達到目標細胞。Ca2+就是可擴散的第二信使之一。然而，Ca2+也可以作為第一信使直接進入細胞，將信號攜帶到細胞靶點，與質(zhì)膜受體的相互作用。而在更多的細胞中，Ca2+則會作為第一信使，與典型的質(zhì)膜受體結(jié)合，觸發(fā)第二信使IP3的形成。Ca2+被第二信使IP3釋放到胞質(zhì)中，稱之為“第三信使”更為正確[16]。

已知Ca2+是體內(nèi)重要的信號分子，調(diào)控許多信號通路。在線粒體中，Ca2+的主要任務是調(diào)節(jié)ATP的產(chǎn)生。Ca2+依賴性磷酸酶激活丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶，加速三羧酸循環(huán)，生成煙酰胺腺嘌呤核苷酸(NADH)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)，這些電子載體為電子傳輸鏈提供動力，最終產(chǎn)生ATP[17]。

線粒體內(nèi)鈣超載，尤其是伴隨著氧化應激時，可能會導致線粒體損傷，最終造成細胞死亡。這種鈣超載引起的細胞病理的發(fā)生是由于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的持續(xù)開放，mPTP是線粒體內(nèi)膜一種非特異性孔隙，可通過分子量高達1.5 kDa的分子。mPTP持續(xù)開放使得線粒體內(nèi)膜Ca2+內(nèi)流的驅(qū)動力消散，減少氧化磷酸化和ATP的合成。此外，高膠體滲透壓還會導致線粒體基質(zhì)腫脹、嵴斷裂展開、內(nèi)膜斷裂，接著通過凋亡或壞死引起細胞死亡[17-18]。

鈣信號傳導在哺乳動物的整個細胞周期中都起著關(guān)鍵作用。在G1期、G1/S轉(zhuǎn)換和有絲分裂期間，細胞內(nèi)的鈣濃度在不斷變化。在G1早期，鈣對于FOS、JUN和MYC等基因的表達以及后來的RB磷酸化反應都很重要。而加入鈣調(diào)素拮抗劑在G1中觸發(fā)細胞周期停滯。鈣調(diào)蛋白的下游靶標鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是細胞周期蛋白D1表達所必需的。鈣/鈣調(diào)蛋白通路還可調(diào)節(jié)幾種轉(zhuǎn)錄因子，如NFAT(活化T細胞核因子)或cAMP反應元件結(jié)合蛋白(CREB)，靶向控制細胞周期從G1進展到S，其中CREB可通過鈣通路被CaMKⅡ和CaMKⅣ誘導磷酸化。磷酸化的CREB與目標基因如細胞周期蛋白 D1啟動子上的cAMP應答元件(CRE)結(jié)合，從而激活轉(zhuǎn)錄[19]。

三、卵細胞中的鈣作用

Ca2+在哺乳動物卵母細胞生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。在卵母細胞的成熟過程中，細胞周期會經(jīng)歷雙線期、MⅠ期和MⅡ期阻滯[20]，而鈣震蕩則使卵母細胞重新進入減數(shù)分裂周期。卵母細胞的胞外介質(zhì)和/或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被觸發(fā)從而釋放Ca2+，激活CaMKⅡ，誘導ROS生成。CaMKⅡ激活、生理范圍內(nèi)活性氧ROS水平的升高和cAMP水平的降低直接或間接觸發(fā)成熟促進因子(maturation promoting factor，MPF)失衡。不穩(wěn)定的MPF最后誘導哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂從雙線期、MⅠ期和MⅡ期的阻滯中恢復[21]。

在卵母細胞受精的過程中，需要Ca2+震蕩信號維持正常受精完成、啟動胚胎發(fā)育信號并維持正常的胚胎發(fā)育。Ca2+被釋放到卵母細胞內(nèi)的確切機制尚未闡明，如今，精子因子假說已得到普遍接受。精子因子(sperm factor，SF)，如磷脂酶C(PLCζ)或后頂體鞘WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(post-acrosomal sheath WW domainbinding protein，PAWP)，擴散到胞質(zhì)啟動分子級聯(lián)反應，該反應主要涉及肌醇磷脂途徑。受精時，PLCζ釋放到胞質(zhì)，水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(hydrolyzes phosphatidylinositol 4，5-biphosphate，PIP2)，生成IP3。IP3與IP3R結(jié)合，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存的鈣釋放。PAWP似乎可與卵母細胞性YAP蛋白(yes-associated protein)結(jié)合，最后激活磷酸肌醇信號轉(zhuǎn)導通路。精子因子的作用導致周期性波樣短暫的鈣釋放，從而產(chǎn)生皮質(zhì)顆粒的胞吐作用，激活卵母細胞，信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)使得卵母細胞受精，轉(zhuǎn)換成二倍體胚胎[22]。

在卵母細胞成熟和激活的過程中，Ca2+震蕩有著重要的作用，因此維持其在卵母細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的。其調(diào)控機制主要包括STIM1、ORAI1、SERCA和PMCAs。STIM1作為低鈣水平傳感器，發(fā)生改變或不足均可能導致卵母細胞的激活不足，它是精子激活的卵母細胞激活因子(SOAF)觸發(fā)生成Ca2+震蕩的關(guān)鍵。當PIP2水解為IP3和DAG，IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的IP3R結(jié)合，這將導致IP3R通道開放，使鈣流出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的STIM1感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度降低后，將使STIM1從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重新定位到質(zhì)膜，與ORAI1通道直接相互作用。此通道隨后打開，并允許鈣進入細胞。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+濃度正常時，STIM1與ORAI1分離，阻止Ca2+內(nèi)流。除了STIM1和ORAI1，SERCA和PMCAs也參與鈣平衡。SERCA位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，將胞漿Ca2+泵到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔。細胞外Ca2+通過ORAI1和其它膜通道蛋白進入細胞質(zhì)后，被SERCA泵入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。這使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+得以補充，而后IP3再與其受體相互作用，從而產(chǎn)生另一個Ca2+震蕩。PMCAs是位于質(zhì)膜而不是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣泵，可將Ca2+從胞外空間泵送到細胞質(zhì)中。目前，尚不清楚SERCAs和PMCAs的改變是否有可能損害卵母細胞激活的能力。這些蛋白同時作用，使得卵母細胞的Ca2+維持穩(wěn)態(tài)，保證Ca2+信號的傳遞和卵母細胞的激活[23]。

四、IVM中Ca2+的作用

體外成熟(IVM)是指從對竇卵泡提取未成熟卵母細胞，并在實驗室條件下培養(yǎng)成熟的方法。IVM可以減少激素類似物的使用，消除卵巢過度刺激綜合征(OHSS) 和可能的長期并發(fā)癥，如激素依賴性腫瘤包括乳腺癌和卵巢癌等，具有一定的臨床優(yōu)勢[24]。然而，迄今為止，使用年輕女性的卵母細胞獲得的臨床妊娠率仍較低[25]。卵母細胞成熟是一個長期的過程，包括細胞核和細胞質(zhì)成熟。細胞核成熟主要涉及染色體分離，以出現(xiàn)兩個極體為成熟的標志。細胞質(zhì)成熟主要涉及細胞器的重新分布以及mRNA、蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子的存儲，以備卵母細胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育之用[5]。細胞質(zhì)成熟十分復雜，目前仍然有許多研究存在爭議。IVM在誘導減數(shù)分裂核成熟方面簡單方便，但在誘導適當?shù)募毎|(zhì)和分子成熟方面則較為復雜，而這對卵母細胞成熟卻是必不可少的[26]。

在IVM取卵過程中，卵母細胞從卵泡環(huán)境中取出時，cAMP濃度急劇降低，卵母細胞減數(shù)分裂自發(fā)恢復，導致細胞質(zhì)的不完全成熟。細胞質(zhì)和細胞核成熟的不同步，將影響卵母細胞的發(fā)育和胚胎質(zhì)量。通過藥理學方法抑制減數(shù)分裂一直是許多研究者的努力，其中一些藥物靶向作用于cAMP通路，如cAMP調(diào)節(jié)劑雙丁酰環(huán)腺苷酸(dbcAMP)、磷酸二酯酶抑制劑西洛酰胺(cilostamide)、腺苷酸環(huán)化酶的刺激劑福司考林(forskolin)等。這些藥物的目的是為了保持高濃度的cAMP，防止體外卵母細胞核過早成熟，從而提供足夠的時間使得卵母細胞的核和胞漿成熟同步。但這些卵母細胞在處理之后，發(fā)育能力通常低于在沒有抑制的情況下培養(yǎng)的卵母細胞[27]。而另一種方法則是調(diào)節(jié)鈣的信號通路。在真核生物中，MPF是最重要的調(diào)節(jié)減數(shù)分裂細胞周期進程的因子，而Ca2+是卵母細胞中重要的信息傳遞分子，細胞內(nèi)Ca2+水平增加，將通過CaMKⅡ激活MPF，使細胞核減數(shù)分裂繼續(xù)進行。使用藥物誘導Ca2+從內(nèi)部存儲釋放，也可引發(fā)體外培養(yǎng)的小鼠、大鼠、牛、豬和人類卵母細胞減數(shù)分裂的自發(fā)恢復。而早在 1992年，科學家們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用BAPTA螯合Ca2+，可以阻止小鼠卵母細胞過早活化的跡象[28]。使用Ca2+通道阻斷劑(維拉帕米和硝苯地平)也能抑制體外培養(yǎng)的小鼠、大鼠、豬和牛卵母細胞減數(shù)分裂自發(fā)恢復。因此在IVM培養(yǎng)基中添加Ca2+抑制因子，通過阻斷細胞內(nèi)Ca2+的水平增加從而阻斷MPF的激活，也可以防止卵母細胞核的早熟。

由此可見，對于IVM卵母細胞核與胞漿成熟不同步的問題，使用Ca2+通道阻斷劑是一種很有潛力的解決方案。現(xiàn)在常規(guī)使用的IVM培養(yǎng)基都是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如TCM-199 medium、Ham’s-F10 medium和Chang’s medium，用碳酸氫鹽和/或HEPES緩沖，并輔以各種血清促性腺激素(FSH、LH)、生長因子和激素，并沒有重視培養(yǎng)基Ca2+水平及其對于卵母細胞的重要作用[29]。目前發(fā)現(xiàn)在囊胚培養(yǎng)基中添加乳酸鈣，似乎對線粒體的功能有積極的作用[30]。但IVM培養(yǎng)基內(nèi)是否要添加、它的濃度是多少，現(xiàn)在尚未可知。同時IVM過程中，細胞在具有5%二氧化碳(CO2)和約20%大氣氧氣(O2)濃度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，但是動物體內(nèi)的氧分壓遠低于大氣氧分壓。細胞暴露于高氧水平能夠增加ROS的產(chǎn)生，可以引起細胞損傷，降低卵母細胞及其胚胎的發(fā)育潛能。同時ROS還會調(diào)節(jié)細胞膜和細胞器的鈣離子通道，改變細胞內(nèi)的鈣分布，從而激活細胞核的成熟[31]?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑，如槲皮素、維生素C和白藜蘆醇等，均可降低體外成熟卵母細胞中的細胞內(nèi)ROS水平，提高胚胎數(shù)量和質(zhì)量[32]。

五、總結(jié)和展望

Ca2+信號的傳導影響細胞生命和死亡的各個方面。在所有生物體內(nèi)，Ca2+是受到最嚴密調(diào)控的離子，細胞膜和細胞器上存在多種通道的調(diào)節(jié)，嚴格調(diào)控胞內(nèi)和細胞器中的Ca2+水平。Ca2+結(jié)合成千上萬的蛋白質(zhì)，以影響它們的定位及功能。在卵母細胞成熟中，必須強調(diào)鈣信號的發(fā)生以及對卵母細胞的影響，以闡明鈣震蕩在卵母細胞成熟和發(fā)育中中的必要作用。對卵母細胞成熟過程中鈣調(diào)節(jié)的研究，有助于了解卵母細胞及胚胎的發(fā)生發(fā)展機制。卵母細胞成熟異常所導致的受精異常和不受精是IVM成功率低的重要原因之一。目前，為改善IVM中卵母細胞核和細胞質(zhì)成熟不同步的問題，研究大多集中在阻止cAMP急劇降低，但成功率并沒有顯著提升。而1992年科學家就發(fā)現(xiàn)Ca2+螯合劑能阻止減數(shù)分裂自發(fā)恢復，防止卵母細胞核過早成熟，從而為細胞質(zhì)成熟提供時間。所以，研究Ca2+在卵母細胞成熟的作用機制，對理解人類卵細胞的發(fā)育機制至關(guān)重要，該研究的結(jié)果將為IVM及體外受精-胚胎移植(IVF-ET)等提供新的理論依據(jù)，從而改善卵子質(zhì)量，提高IVM的成功率。

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