劉曉俠,尤忠毓,王玉潔,孫世元

我國是毛絨制品生產(chǎn)、加工、出口大國,毛絨類纖維的總加工量居世界第一[1]。羊絨作為重要的毛絨類產(chǎn)品之一,其細度均勻,手感滑糯柔軟而細膩,拉力強而富有彈性,質(zhì)感、手感、保暖性等明顯優(yōu)于其他毛絨制品,素有“軟黃金”之稱[2-3]。一些不法生產(chǎn)廠商為達到降低成本提高利潤的目的,在加工羊絨制品過程中往往摻入價值相對較低的其他纖維,如綿羊絨、改性綿羊毛、拉細綿羊毛和羊駝絨等,這些摻假行為不僅損害了消費者的利益,更影響了我國毛絨產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

毛絨類纖維現(xiàn)有的鑒別方法,主要是根據(jù)GB/T 16988-2013《特種動物纖維與綿羊毛混合物含量的測定》的規(guī)定,使用投影顯微鏡對山羊絨[4]、兔毛、羊駝毛等絨毛類型的各組分纖維含量的測定。該鑒別方法過分依賴于檢測人員的工作經(jīng)驗,而對羊絨、改性綿羊毛和羊駝絨等形態(tài)結(jié)構(gòu)極其相似的纖維,這種方法顯現(xiàn)出其局限性,已不能滿足毛絨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求。近年來發(fā)展起來的圖像識別法[5]、紅外光譜法[6]、實時定量PCR法[7]、基因探針法[8-9]、靶向蛋白質(zhì)組技術(shù)[10]和生物芯片法[11]等雖各有千秋,卻均因各種原因難以推廣。

隨著各種毛絨混紡織物的大量出口,毛絨類纖維的成分鑒定工作已成為維護商家與消費者權(quán)益,增加我國國際市場競爭力以及打擊假冒劣偽產(chǎn)品的重要一環(huán),也一直是紡織檢測行業(yè)具有挑戰(zhàn)性的課題之一,已成為業(yè)界亟待解決的問題。

本研究旨在利用基因擴增技術(shù),對毛絨制品實現(xiàn)快速準確地定性鑒定。

1 試驗部分

1.1 材料和儀器

標準參考材料:從內(nèi)蒙古收集來的純羊絨,以及上海第一紡織有限公司生產(chǎn)的細羊毛、羊駝絨。一般沒有市售的參考纖維混合物,纖維混紡是由兩種或三種不同的參考材料(羊絨/羊毛/羊駝)定量混合制備(表1和表2),這些參考混合物通過顯微鏡檢查進行了分析。

試劑:Bio miga試劑盒;儀器:PCR擴增儀(5331型,Ger many),冷凍干燥器(6870 SPEX Sa mplePrep Freezer/Mill?,USA)。

1.2 毛絨制品線粒體DNA的提取與擴增

研究和開發(fā)動物纖維的DNA檢測,關(guān)鍵技術(shù)難點在于DNA的提取[3,12]。特別是經(jīng)過染色、整理等加工處理的毛絨制品,更難獲得高質(zhì)量的可用于進一步分析的DNA片段,而PCR技術(shù)只需微量的DNA樣品,就能很好地解決上述問題,因此基于線粒體DNA片段的PCR技術(shù)是一種理想的選擇。

纖維在冷凍干燥器用液氮研磨加工成細小的顆粒。研磨時注意以下條件:先預冷5 min,然后以10次/s的速率運行,1 min內(nèi)運行2個循環(huán),再冷卻1 min。選用Bio miga試劑盒,按說明書步驟稍作改進,將粉碎的毛絨制品進行蛋白酶、DTT預處理→高效裂解→柱分離→獲取線粒體DNA等步驟,分別提取羊絨、羊毛,羊駝的線粒體 DNA,并以此為模板進行PCR特異性擴增。PCR反應條件為:95℃預變性5 min,95℃變性30 s,35℃復性45 s,72℃延伸30 min,經(jīng)過30個循環(huán)后,最后72℃延伸10 min。

表1 試驗用毛絨織物

表2 試驗用混紡毛絨織物

2 結(jié)果與討論

2.1 引物的設(shè)計

從Genbank中分別搜索山羊、綿毛和羊駝的Cytb基因,利用Vector NIT軟件中align程序進行序列比對,利用比對的非同源性序列設(shè)計特異性引物,并確保擴增的羊毛、羊絨及羊駝絨的Cytb基因片段長度不同,設(shè)計引物見表3。

表3 不同來源的Cytb基因片段的引物序列

Cytb基因是編碼線粒體內(nèi)膜細胞色素b氧化酶基因的一個亞基,參與氧化磷酸化合成ATP過程。Cytb基因核苷酸序列總長為1 140 bp,編碼379個氨基酸。Cytb基因進化速度適中,易用一些通用引物對所檢測的物種進行擴增測序,較小的一段基因片段包括了科間、屬間、種間乃至種內(nèi)的遺傳信息,適合于分析種間或者屬間的差異被認為是解決系統(tǒng)分類和進化問題最可信的遺傳標記之一[13],已被廣泛應用到動物的分子鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析和起源與進化的研究中。

利用以上引物序列分別對山羊、綿羊及羊駝的線粒體基因組進行擴增,根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小不同,可分別鑒別出羊絨、羊毛和羊駝絨。

2.2 羊毛、羊絨及羊駝絨的定性

從理論上分析,如果樣品中僅存在羊絨、羊毛或羊駝纖維,那么用相應的引物可以擴增出目的條帶,但用其他引物則無擴增結(jié)果。

分別采用羊毛、羊絨及羊駝引物進行擴增相應的毛絨,擴增結(jié)果見圖1至圖3。

圖1 羊絨樣品的的擴增結(jié)果

圖2 羊毛樣品的的擴增結(jié)果

圖3 羊駝絨樣品的擴增結(jié)果

從圖1、圖2和圖3可知,分別利用羊毛、羊絨和羊駝的Cytb基因片段設(shè)計的特異性引物,使不同來源的Cytb基因片段均得到特異性擴增。

2.3 羊絨/羊毛混合物的DNA檢測靈敏度

當樣品中羊絨、羊毛及羊駝絨纖維的含量分別為0.5%、1%、5%、10%、20%。利用相應的Cyt b引物進行特異性擴增,結(jié)果見圖4。

圖4 Cyt b基因片段的擴增結(jié)果

由圖4可知,當混合樣品中羊絨比例、羊毛比例或羊駝絨的比例≥0.5%時,利用設(shè)計的特異性引物,PCR擴增技術(shù)均能準確定性。

2.4 羊絨、羊毛、羊駝混合物定性

理論上分析,如果樣品中同時存在羊絨、羊毛和羊駝絨纖維,利用設(shè)計的特異性引物,可以同時擴展出三條長度不同的條帶,只有當羊絨、羊毛或羊駝絨的含量很低時才有可能導致相應條帶的不顯著。

將羊絨,羊毛和羊駝絨纖維按不同比例混合(見表2),采用表3中的引物,進行PCR擴增實驗,結(jié)果見圖5。

圖5 不同來源的Cytb基因片段的擴增結(jié)果

從圖5中可以看出,混合樣品中同時檢測多種成分時,羊絨含量僅為0.5%時,就有相應的擴增條帶,當混和樣品中羊駝絨的含量≥5%時,有相應的擴增條帶。

3 結(jié)論

(1)基于不同生物Cytb基因非同源性序列設(shè)計特異性引物,進行PCR擴增定性鑒別羊絨、羊毛和羊駝絨,只要某一毛絨的含量≥0.5%,就可利用DNA技術(shù)定性鑒別出羊絨、羊毛或羊駝絨組分的存在。

(2)對于羊絨、羊毛和羊駝絨的混合物,當羊絨含量≥0.5%,羊駝絨含量≥5% 時,PCR擴增技術(shù)定性可同時鑒別羊絨、羊毛及羊駝絨纖維,避免了人為因素的影響,檢測準確性、靈敏度極高,對解決貿(mào)易糾紛,尤其是國際性貿(mào)易爭端可以發(fā)揮重要作用。

(3)分別針對羊絨、羊毛及羊駝絨纖維Cytb基因設(shè)計特異性引物的擴增技術(shù),有效提高了羊絨檢測的靈敏度,為PCR技術(shù)在毛絨制品方面的推廣應用奠定了基礎(chǔ),同時為基于PCR技術(shù)的羊絨、羊毛及羊駝絨纖維定性檢測研究提供了有力的技術(shù)保障。

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