王淑麗 張晶晶 侯玉華

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌;Foxm1;Gli2;Hh信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：R737.9?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.01.020

Expression of Foxm1 and Gli2 and its clinical significance in breast cancer

WANG Shuli，ZHANG Jingjing，HOU Yuhua

【Abstract】 Objective To analyze the expression of Foxm1 and Gli2 in breast cancer tissues，and to discuss the effect of the two in the occurrence，progression，invasion and metastasis of breast cancer，so as to provide reference indexes for the diagnosis and metastasis evaluation of breast cancer.

Methods 106 specimens of breast cancer were collected，including 68 cases of invasive breast cancer and 38 cases of breast fibroadenoma. A total of 40 cases of normal breast tissue beside the cancer were taken as controls. Immunohistochemical method was used to detect the expression of Foxm1 and Gli2 in these specimens. Relationship between the expression of Foxm1 and Gli2 in breast cancer tissues as well as relationship between them and the clinical characteristics of breast cancer were analyzed.

Results The expression levels of Foxm1 protein and Gli2 protein in breast cancer tissues were significantly higher than those in breast fibroadenoma tissues and normal breast tissues （P<0.05）.The positive rates of Foxm1 and Gli2 in breast cancer tissues with lymph node metastasis were higher than those without lymph node metastasis （P<0.05）.Spearman correlation analysis showed that Foxm1 was positively correlated with Gli2 （r=0517，P<0.001）.

Conclusion Foxm1 and Gli2 are highly expressed in breast cancer tissues，they have certain correlation，and may involve in the process of occurrence，invasion and metastasis of breast cancer.Therefore，the detection of expression levels of them? may be of guiding significance for the diagnosis of breast cancer and the assessment of whether there is a metastasis.

【Key words】 breast cancer;Foxm1;Gli2;Hh signaling pathway

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，它對(duì)女性的健康造成了極大威脅，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是引起患者死亡的重要原因。近年來，雖然腫瘤治療手段已取得了極大進(jìn)展，但乳腺癌的常規(guī)治療效果并不理想。近期的研究證實(shí)，分子靶向藥物治療可有效延長(zhǎng)乳腺癌患者的生存期，改善其生活質(zhì)量[1]。故了解乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展的信號(hào)通路及關(guān)鍵分子，找到乳腺癌的治療靶點(diǎn)是廣大學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。Foxm1是一種特異性細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)錄因子，它對(duì)細(xì)胞周期變化具有調(diào)節(jié)作用，參與了乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展過程[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxm1的轉(zhuǎn)錄受Hedgehog（Hh）信號(hào)通路的下游轉(zhuǎn)錄因子Gli2調(diào)控，Gli2基因是Hh信號(hào)通路的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。腫瘤的增殖是通過解除細(xì)胞周期的控制，活化Hh信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)[3]。本研究采用免疫組化法檢測(cè)乳腺癌、良性乳腺腫瘤及正常乳腺組織中的Foxm1、Gli2蛋白表達(dá)，以探討兩者在乳腺癌中的作用機(jī)制及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

收集2015年8月至2017年2月在河南鄭州市中心醫(yī)院婦科手術(shù)切除并進(jìn)行石蠟包埋的乳腺腫瘤標(biāo)本106例，其中浸潤(rùn)性乳腺癌68例，乳腺纖維腺瘤38例。另以癌旁正常乳腺組織作為對(duì)照，共40例。上述標(biāo)本的患者均為初次發(fā)病，年齡30～72歲，平均年齡為（53.6±6.1）歲，術(shù)前未接受其他方法治療。所有病理診斷均由本院經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生確認(rèn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗人Foxm1多克隆抗體（美國(guó)ABGENT公司），Gli2多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），抗體工作液和DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）。

1.3 免疫組化法檢測(cè)

將上述標(biāo)本石蠟切片脫蠟、梯度酒精脫水，室溫下置于3%過氧化氫溶液終孵育5～10 min，PBS沖洗3次，每次5 min。血清封閉，滴加抗Foxm1、Gli2一抗（Gli2按1∶200，F(xiàn)oxm1按1∶300稀釋），4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，每次5 min，滴加對(duì)應(yīng)二抗工作液，37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min，滴加生物素標(biāo)記的二抗，滴加少量DAB顯色液反應(yīng)3 min，復(fù)染、脫水、鏡檢。以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

Foxm1蛋白定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，陽性染色時(shí)胞漿和胞核呈淡黃、棕黃色甚至棕褐色;Gli2蛋白定位于細(xì)胞漿，陽性染色時(shí)胞漿呈淡黃、棕黃色甚至棕褐色。根據(jù)鏡下切片染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞的占比評(píng)分。染色強(qiáng)度：無染色計(jì)0分;淡黃色計(jì)1分;深黃色計(jì)2分;棕褐色計(jì)3分。陽性細(xì)胞占比<5%計(jì)0分;陽性細(xì)胞占比為5%～25%計(jì)1分;陽性細(xì)胞占比為26%～50%計(jì)2分;陽性細(xì)胞占比為51%～75%計(jì)3分;陽性細(xì)胞占比為76%～100%計(jì)4分。免疫組化評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽性細(xì)胞占比評(píng)分[4]。免疫組化評(píng)分總分為0～12分，分為：陰性（≤1分）、弱陽性（≤3分）、陽性（≤6分）、強(qiáng)陽性（>6分）。免疫組化評(píng)分2分及以上者表示陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（±s）表示，多組間比較用協(xié)方差分析，兩兩比較用SNK法檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)oxm1與Gli2間的關(guān)系用Spearman等級(jí)相關(guān)性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)? 果

2.1 乳腺癌組織、乳腺纖維腺瘤組織及正常乳腺組織中的Foxm1、Gli2蛋白表達(dá)情況

Foxm1蛋白在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均有表達(dá)，正常乳腺組織少量表達(dá)或無表達(dá)，乳腺纖維腺瘤弱陽性表達(dá)，乳腺癌組織強(qiáng)陽性表達(dá)（見圖1）。Gli2蛋白表達(dá)于胞漿，正常乳腺組織極少表達(dá)或無表達(dá)，乳腺纖維腺瘤弱陽性表達(dá)，乳腺癌組織表達(dá)明顯增強(qiáng)（見圖2）。乳腺癌組織Foxm1蛋白、Gli2蛋白表達(dá)評(píng)分高于乳腺纖維腺瘤組織和正常乳腺組織（P<0.05）。見表1。

2.2 Foxm1和Gli2的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

Foxm1和Gli2的表達(dá)與乳腺癌患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的乳腺癌組織的Foxm1和Gli2的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 Foxm1與Gli2表達(dá)的關(guān)系

Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)oxm1與Gli2呈正相關(guān)（r=0.517，P<0.001）。

3 討? 論

Foxm1為叉頭框蛋白家族，是一類具有嚴(yán)格細(xì)胞核定位，DNA結(jié)合區(qū)具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。它屬于增殖特異性蛋白，可通過調(diào)控細(xì)胞周期來促進(jìn)細(xì)胞增生和有絲分裂，在靜止或未分化細(xì)胞中低表達(dá)或無表達(dá)，而在增殖細(xì)胞中高表達(dá)[5]。Foxm1的活化過程中是多因子、多細(xì)胞信號(hào)通路共同參與作用的結(jié)果，信號(hào)通路包括Hh信號(hào)通路和Ras-MAPK信號(hào)通路[6]。Hh信號(hào)通路是由Hh配體、跨膜蛋白質(zhì)受體patched和Smoothened組成的受體復(fù)合物、下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白（Gli1、Gli2、Gli3）等組成，它的激活與多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及侵襲和轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)[7]。有研究報(bào)道，敲除Gli2基因可使其相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低，且會(huì)極大降低Foxm1的表達(dá)水平，提示Gli2與Foxm1在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中可能有一定的關(guān)系[8]。Gli2作為Hh信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子之一，對(duì)下游多種靶基因的表達(dá)具有調(diào)控作用，如與細(xì)胞增殖、分化有關(guān)的基因（cyclin D1）、抗凋亡基因Bcl2等[9]。大量研究報(bào)道，在多種惡性腫瘤（如基底細(xì)胞癌、前列腺癌、肺癌等）中均有Gli2的異常高表達(dá)，其過表達(dá)與低預(yù)后有關(guān)[10]。而且Foxm1作為Hh信號(hào)通路的下游靶基因，Hh信號(hào)通路活化后可上調(diào)Foxm1基因的表達(dá)[11]。??蓋領(lǐng)等人[12]研究顯示，F(xiàn)oxm1在乳腺浸潤(rùn)癌中的表達(dá)顯著升高，其表達(dá)水平與腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。李周芳等[13]研究指出，F(xiàn)oxm1在乳腺癌細(xì)胞增殖過程中起重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，正常乳腺組織中Foxm1呈低表達(dá)或不表達(dá)，乳腺纖維腺瘤組織表達(dá)量有所增加，而乳腺癌組織中表達(dá)量顯著增高，染色強(qiáng)度明顯強(qiáng)于正常乳腺組織和乳腺纖維腺瘤;而且在乳腺癌組織中，F(xiàn)oxm1雖與患者年齡、腫瘤直徑、組織分級(jí)及臨床分期無明顯相關(guān)性，但在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，說明Foxm1蛋白表達(dá)上調(diào)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，Gli2蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平也明顯高于正常乳腺組織和乳腺纖維腺瘤組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系與Foxm1相似。Spearman秩和相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)oxm1與Gli2呈正相關(guān)，這一結(jié)果佐證了Gli2作為Hh信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子，其對(duì)作為Hh信號(hào)通路下游靶基因的Foxm1的表達(dá)具有調(diào)控作用。

綜上所述，F(xiàn)oxm1、Gli2在乳腺癌組織中均高表達(dá)，兩者存在一定的相關(guān)性，可能參與了乳腺癌的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移過程，因此對(duì)兩者表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，可能對(duì)乳腺癌的診斷及是否轉(zhuǎn)移的評(píng)估具有指導(dǎo)意義。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 甘紹舉，王 青，朱麗敏，等.靶向治療藥物在乳腺癌中的研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2015，35（1）：134-137.

[2] 周 磊，張萍海，徐 欣，等.下調(diào)叉頭轉(zhuǎn)錄因子M1基因表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲能力的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2009，89（34）：2424-2426.

[3] 石 超.Gli2通過FoxM1調(diào)控KIF20A影響肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制[D].南昌：南昌大學(xué)，2015.

[4] 楊建敏，胡靜文.Foxm1 蛋白在人宮頸癌組織中的表達(dá)及與病理類型、分級(jí)、分期之間的關(guān)系[J].廣東醫(yī)學(xué)，2015，37（14）：2150-2152.

[5] 孔飛飛，袁海花，王炯軼，等.Foxm1對(duì)非小細(xì)胞肺癌中 MMP-2、MMP-9和遷移侵襲的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，26（8）：1775-1778.

[6] 馮亞光，魏正強(qiáng)，曾紹兵，等.Gli1和Foxm1在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)腫瘤臨床，2012，39（7）：377-381.

[7] 陳 丹，陳 紅，董良波，等.Gli1與FoxM1在子宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2016，37（3）：430-435.

[8] Chen H，Zou Y，Yang H，et al.Downregulation of FoxM1 inhibits proliferation，invasion and angiogenesis of HeLa cells in vitro and in vivo[J].Int J Onc，2014，45（6）：2355-2364.

[9] 林中嘯，蔡 銘，虞曉明，等.Gli2在髓母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其靶向抑制劑的作用與意義[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2015，44（4）：66-70.

[10] Buczkowicz P，Ma J，Hawkins C.GLI2 is a potential therapeutic target in pediatric medulloblastoma[J].J Neur Exp，2011，70（6）：430-437.

[11] 張大偉，曹良啟，盧海武，等.Hedgehog 信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子Gli2在肝癌組織中的表達(dá)及意義[J].中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)（電子版），2013，7（1）：12-16.

[12] 蓋 領(lǐng)，茅國(guó)新，趙鈴鈴，等.FOXM1在人乳腺癌組織和MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2015，35（8）：1100-1105.

[13] 李周芳，高 偉，李惠翔.FoxM1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2013，26（3）：195-197.