王紅霞 張一卉 李景娟 賀立龍 高建偉

摘要：CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）系統(tǒng)是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種抵抗病毒及質(zhì)粒入侵的獲得性免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)由sgRNA（single guide RNA） 及Cas9核酸酶組成，具有可操作性及效率高的優(yōu)點(diǎn)，已被成功運(yùn)用于多種植物基因組編輯，如小麥、水稻、玉米等。本文簡(jiǎn)要闡述了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)、分類、結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制，重點(diǎn)綜述了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物方面的研究進(jìn)展及前景，以期為利用基因組編輯技術(shù)改良農(nóng)作物的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性等重要農(nóng)藝性狀提供參考。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9；植物；基因組編輯

中圖分類號(hào)：S336：Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）02-0143-08

Abstract CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9） is an acquired immune system of bacteria and archaea， which can protect against virus and plasmid invasions. The system consists of sgRNA （single guide RNA） and Cas9 nuclease， which has advantages of maneuverability and high efficiency. It has been successfully applied to genome editing in a variety of plant species， such as wheat， rice， maize， etc. In this article， we briefly described the discovery， classification， structure and mechanism of CRISPR/Cas9 system， and focused on the research progress， development and prospect of CRISPR / Cas9 system application in plants， which would help us to improve crop plants in important agronomic traits such as yield， quality and disease resistance by genome editing technology.

Keywords CRISPR/Cas9； Plant； Genome editing

精準(zhǔn)編輯基因組對(duì)植物重要基因功能研究、農(nóng)作物遺傳育種具有重要推動(dòng)作用。許多研究者利用各種核酸內(nèi)切酶如“基因組剪刀”編輯植物基因組，產(chǎn)生功能缺失突變體或?qū)Ω信d趣的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)修飾，研究相關(guān)基因的功能及其作用機(jī)制。

鋅指核酸酶（zinc-finger nuclease， ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物（transcription activa-tor-like effector， TALEN） 是20世紀(jì)人類發(fā)現(xiàn)的基因組編輯工具，它們不僅被成功應(yīng)用于植物基因組改造，并有望改革傳統(tǒng)植物育種及基因組修飾。在ZFNs和TALENs基因組編輯系統(tǒng)中，首先，DNA結(jié)合蛋白和核酸內(nèi)切酶FokⅠ融合形成人工核酸內(nèi)切酶[1，2]，而人工核酸內(nèi)切酶識(shí)別并切割特異DNA序列造成DSBs（double-strand breaks），最后通過(guò)非同源末端連接或同源重組的方式實(shí)現(xiàn)基因組堿基插入、刪除或突變[3]（圖1）。ZFNs和TALENs是兩種有效的基因組編輯工具，但是也有其自身無(wú)法克服的缺點(diǎn)。在ZFNs應(yīng)用中，大分子蛋白的設(shè)計(jì)與構(gòu)建既昂貴又費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此ZFNs的應(yīng)用在許多植物中受到限制[4]。而在TALENs應(yīng)用中，基因組編輯的脫靶率高、穩(wěn)定性差[5]。因此，尋找一種簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定且成本低的基因組編輯技術(shù)迫在眉睫。2013年，CRISPR/Cas9技術(shù)由于能夠高效快捷地編輯目標(biāo)基因組且成本較低，被Science雜志評(píng)為年度十大科學(xué)進(jìn)展之一。該系統(tǒng)由RNA引導(dǎo)并由Cas9行使剪切功能。與ZFNs和TALENs技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)不需要設(shè)計(jì)蛋白，只需改變gRNA（guide RNA）序列中20 nt特殊片段。CRISPR/Cas9技術(shù)已被成功運(yùn)用于許多植物的基因組編輯中[6]。本文將簡(jiǎn)要介紹CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制，重點(diǎn)介紹其在植物農(nóng)作物方面的最新研究進(jìn)展。

1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)

1.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

1987年，日本科學(xué)家在大腸桿菌基因組研究中發(fā)現(xiàn)一段特殊串聯(lián)間隔重復(fù)序列（圖2），但功能未知[8]。2002年，Jansen等[9]將該序列結(jié)構(gòu)正式命名為成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeat， CRISPR）。在研究初期，由于缺乏病毒及外源質(zhì)粒序列信息，CRISPR行使的確切功能并未闡明，但隨著測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)的發(fā)展，有研究小組發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR序列中的間隔序列與細(xì)菌病毒的遺傳物質(zhì)具有高度同源性[10-12]，因此，科學(xué)家推測(cè)該序列可能與細(xì)菌抵抗外源遺傳物質(zhì)入侵有關(guān)。根據(jù)這一假設(shè)， Barrangou[13]和Marraffini[14，15]等的研究先后發(fā)現(xiàn)并證明CRISPR系統(tǒng)可以幫助細(xì)菌抵抗外源噬菌體入侵并阻止外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，也首次通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證了CRISPR系統(tǒng)的功能。這一系列研究表明，CRISPR/Cas9作為全新的細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)，已經(jīng)成為當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域中最為炙手可熱的技術(shù)之一。

1.2 CRISPR系統(tǒng)的分類

細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成了復(fù)雜的CRISPR適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其根據(jù)Cas蛋白及其序列的不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型（表1）。本文將主要介紹CRISPRⅡ型系統(tǒng)，由于它不需要依賴復(fù)雜的蛋白復(fù)合物且極易操作，目前已廣泛應(yīng)用于各植物基因組編輯中。

1.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的系統(tǒng)，它首次被發(fā)現(xiàn)于產(chǎn)膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes SF370）[19]。其基因座主要包括三部分根據(jù)干擾靶標(biāo)不同分為TypeⅢA和TypeⅢB兩種類型，前者靶標(biāo)是mRNA[17]，后者是DNA[14]。主要參與crRNA的成熟和剪切外源入侵DNA[18]。

（圖3a）：5′端是編碼tracrRNA（transactivating CRISPR RNA）的基因，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以與CRISPR RNA（crRNA）互補(bǔ)結(jié)合，指導(dǎo)Cas9行使功能；中間為編碼Cas蛋白的相關(guān)基因，用于剪輯外源DNA；3′端由多個(gè)高度重復(fù)序列（repeat）和間隔序列（spacer）形成的R-S結(jié)構(gòu)及其前導(dǎo)序列組成。細(xì)菌首先需要采集外源入侵短片段DNA（30～50 bp），其作為前間隔序列（protospacer）被插入到CRISPR位點(diǎn)，由重復(fù)序列隔開(kāi)，形成“記憶”。當(dāng)細(xì)菌再次遭到類似外源DNA入侵時(shí)，CRISPR基因座表達(dá)，轉(zhuǎn)錄形成接近40 nt的前體crRNA，然后借助RNA酶Ⅲ促使crRNA成熟并與tracrRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成gRNA （guide RNA），激活并誘導(dǎo)Cas9蛋白催化DNA剪切[13]。Cas9蛋白是具有HNH及RuvC核酸酶活性結(jié)構(gòu)域的功能蛋白，其功能域分別負(fù)責(zé)剪切與CRISPR互補(bǔ)的目標(biāo)DNA鏈及非互補(bǔ)鏈，使雙鏈斷裂[19]。Cas9蛋白主要識(shí)別靠近20 bp目標(biāo)序列3′末端的較為保守的共有序列，該共有序列被稱為PAM序列（protospacer adjacent motif），通常為“NGG”[19，20]，但也有研究發(fā)現(xiàn)Cas9在極少情況下也可識(shí)別“NAG”序列[21]。

隨著該系統(tǒng)作用機(jī)制日趨明朗，研究者設(shè)計(jì)在體外組裝crRNA與tracrRNA雜交形成嵌合RNA分子， 指導(dǎo)Cas9蛋白切割目的基因， 形成 DSBs（double strand breaks，圖3b）。科學(xué)家已經(jīng)證明該嵌合RNA分子（sgRNA）不但在體外具有功能，并可使目標(biāo)序列雙鏈斷裂。該項(xiàng)技術(shù)在許多實(shí)驗(yàn)室已逐步趨向成熟。

（a）細(xì)菌typeⅡCRISPR/Cas9系統(tǒng)：trans-activating crRNA （tracrRNA）與pre-crRNA重復(fù)區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)并經(jīng)RNaseⅢ切割，形成成熟crRNA。Cas9在成熟crRNA引導(dǎo)下通過(guò)間隔序列識(shí)別目標(biāo)序列，誘導(dǎo)雙鏈斷裂，抵御外源DNA侵入。（b）嵌合RNA（sgRNA）分子形成。

體外組建crRNA和tracrRNA形成一條單鏈gRNA （guide RNA），導(dǎo)入并編輯目標(biāo)基因組位點(diǎn)。

2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)最新研究進(jìn)展

2.1 載體系統(tǒng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)使植物基因組編輯更加方便快捷，但多項(xiàng)試驗(yàn)證明其編輯效率相對(duì)較低[23，24]。因此，各種CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生，包括基因敲除、敲進(jìn)，基因組缺失、破壞等等，這些載體系統(tǒng)的成功構(gòu)建大大提高了植物基因組編輯效率。

2014年，Nishimasu等[25]構(gòu)建了一個(gè)含有98個(gè)核苷酸（包括20 nt目標(biāo)序列）的典型sgRNA，它能夠指導(dǎo)Cas9/sgRNA復(fù)合物行使功能。sgRNA的表達(dá)通常由核內(nèi)小RNA基因啟動(dòng)子U3和U6所驅(qū)動(dòng)，許多研究者通常用帶有目標(biāo)序列的U3/U6-啟動(dòng)子-sgRNA表達(dá)組件來(lái)行使功能[23]。2015年，Xie等[26]通過(guò)在sgRNA兩側(cè)添加多順?lè)醋覴NA的前導(dǎo)序列構(gòu)建了sgRNA載體系統(tǒng)。許多研究證明，經(jīng)過(guò)密碼子最優(yōu)化Cas9基因（Cas9p）也能夠提高植物基因組編輯效率[23，24，27]。Ma等[28]進(jìn)一步通過(guò)提高Cas9p 5′末端的G/C含量使編輯效率更大提升。在早期研究中，為了使sgRNA和Cas9表達(dá)組件能夠協(xié)調(diào)而易于進(jìn)入植物組織細(xì)胞，人們通常用一個(gè)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)直接將載有sgRNA和Cas9表達(dá)組件的質(zhì)粒導(dǎo)入原生質(zhì)體中，但這很難獲得可遺傳的目標(biāo)基因突變的轉(zhuǎn)基因植株[29]。于是，Shan等[24]通過(guò)基因槍法將完整的Cas9和sgRNA表達(dá)結(jié)構(gòu)擊入愈傷組織和未成熟的胚，從而使植物產(chǎn)生了可遺傳突變。Svitashev等[30]也用同樣方法在體外誘導(dǎo)了目標(biāo)基因突變。此外，有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)農(nóng)桿菌滲入法將帶有sgRNA表達(dá)組件的煙草花葉病毒DNA導(dǎo)入經(jīng)Cas9轉(zhuǎn)化的煙草中能夠使CRISPR/Cas9更好地發(fā)揮功能[31]。農(nóng)桿菌及病毒性系統(tǒng)由于DNA會(huì)被最大限度組裝并打包，因而不能大量暴露其序列使其轉(zhuǎn)錄，從而了限制gRNA的表達(dá)數(shù)量。Zhao等[32]通過(guò)將兩個(gè)核酸酶、HH（hammerhead）和另外一個(gè)來(lái)自于丁型肝炎病毒（HDV）的基因分別克隆到gRNA的下游和上游，從而使其前體RNA準(zhǔn)確切割形成有功能的gRNA。

2.2 多基因位點(diǎn)同時(shí)編輯

植物多基因位點(diǎn)同時(shí)編輯已經(jīng)有很多應(yīng)用，如冗余基因敲除、作物育種中多性狀的遺傳改良等等。早期，研究者通過(guò)連續(xù)循環(huán)克隆將含有不同目的片段的sgRNA表達(dá)組件插入到一個(gè)二元載體中，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)同時(shí)編輯[23，33，34]；或者利用多重限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生不同粘性末端的方法將sgRNA表達(dá)組件插入不同位點(diǎn)[33，35]。這些方法不僅限制了sgRNA表達(dá)組件的插入數(shù)量，而且較為耗時(shí)。受到Golden Gate克隆技術(shù)[36]的啟發(fā)，2015年，Ma等[28]利用Golden Gate克隆了水稻具有多個(gè)組件的CRISPR/Cas9的二元結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)行單一循環(huán)克隆實(shí)現(xiàn)了8個(gè)位點(diǎn)的插入、7個(gè)類似FT的基因同時(shí)突變。2017年，F(xiàn)erreira等[37]課題組利用來(lái)自假單胞菌的內(nèi)切核糖核酸酶Csy4對(duì)RNA的加工能力，將基因組編輯的一條RNA加工形成多條gRNAs，同時(shí)對(duì)釀酒酵母4個(gè)基因FAA1、FAA4、POX1和TES1進(jìn)行刪除編輯，其效率達(dá)到96%。

3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在植物方面的應(yīng)用

2013年，Li等[23]首次利用CRISPR/Cas9 編輯系統(tǒng)在植物體內(nèi)共表達(dá)經(jīng)密碼子最優(yōu)化的Cas9和gRNA，誘導(dǎo)擬南芥（Arabidopsis）和本生煙（Nicotiana benthamiana）特定基因突變，結(jié)果顯示，擬南芥基因突變頻率在5.6%以下，而本生煙的突變頻率在38%左右，該項(xiàng)研究結(jié)果第一次證明gRNA/pcoCas9系統(tǒng)能夠在植物基因組中發(fā)揮作用。隨后，各課題組也陸續(xù)展開(kāi)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在其他植物中的研究，包括小麥、玉米、水稻、高粱等（見(jiàn)表2）。2013年，Jiang等[29]也以擬南芥、番茄、高粱和水稻作為試驗(yàn)材料，證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種靈巧、功能強(qiáng)大的基因組編輯系統(tǒng)，可以短期應(yīng)用于模式植物及作物基因組編輯。2014年，F(xiàn)eng等[39]同樣利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，研究了不同世代具有12個(gè)不同目標(biāo)基因位點(diǎn)的3個(gè)擬南芥基因，結(jié)果顯示不同世代擬南芥的突變率分別為T1代71.2%，T2代58.3%，T3代79.4%。2015年，Yan等[34]利用YAO啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)也實(shí)現(xiàn)了擬南芥高效率基因組編輯。2017年，Tang等[40]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除了水稻中OsNramp5基因，產(chǎn)生了低積累鎘（Cd）的秈稻，而不會(huì)降低產(chǎn)量。同年，Odipio課題組也成功地利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在木薯基因組中實(shí)現(xiàn)了多等位基因突變。由此可見(jiàn)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是應(yīng)用于植物基因組編輯的一種新興技術(shù)。經(jīng)過(guò)這幾年發(fā)展，科學(xué)家應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因刪除、添加、激活或抑制，以研究植物基因功能及分子機(jī)制。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也可用于改進(jìn)作物重要農(nóng)藝性狀，如產(chǎn)量、抗病性、抗脅迫能力、提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等。研究表明，重要農(nóng)藝性狀可以通過(guò)敲除或下調(diào)負(fù)調(diào)控基因得以控制。例如，

Wang等[41]通過(guò)敲除小麥中3個(gè)TaMLO同源白粉病易感基因而使其具有抗性；Liu等[42]將水稻中的ERF轉(zhuǎn)錄因子基因OsERF922進(jìn)行突變，從而提高了水稻對(duì)真菌的抗性。2015年，Belhaj等[22]研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以作為細(xì)菌的一種抗病毒工具，其能夠通過(guò)剪切病毒DNA來(lái)抑制DNA病毒感染植物。2017年，Zhang等[43]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)使粳稻品種中Waxy基因發(fā)生功能缺失突變，使粳稻轉(zhuǎn)化為糯稻，而不會(huì)影響其他理想的農(nóng)藝性狀，這為改善優(yōu)秀品種的粘性提供了一個(gè)有效和簡(jiǎn)便的策略。

目前，許多科學(xué)家已成功運(yùn)用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了植物目的基因的高效率敲除。然而，通過(guò)該系統(tǒng)成功敲進(jìn)或替換目標(biāo)片段卻極少報(bào)道。研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也可以通過(guò)HR（homologous recombination）方式編輯目標(biāo)片段。盡管HR的效率遠(yuǎn)低于NHEJ（non-homologous end joining），但通過(guò)HR能夠更加準(zhǔn)確地在目標(biāo)位點(diǎn)引入新的片段。2015年，Cermak等[53]為擴(kuò)大模板供體序列設(shè)計(jì)了雙生病毒系統(tǒng)，用以促進(jìn)HR修復(fù)途徑精確編輯。同時(shí)，Endo等[54]研究發(fā)現(xiàn)由于DNA連接酶Ⅴ參與NHEJ修復(fù)途徑，因此可以通過(guò)抑制DNA連接酶Ⅴ促進(jìn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲進(jìn)或替換目標(biāo)片段。

2014年，Schiml等[55]第一次通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用HR介導(dǎo)的修復(fù)機(jī)制成功在擬南芥的ADH1基因位點(diǎn)導(dǎo)入了具有卡那抗性的片段。2015年，Cermak等[53]也利用同樣的方法在番茄中導(dǎo)入卡那抗性的片段，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因組編輯。同年，Svitashev等[30]利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和離子轟擊在玉米中引入了Cas9、gRNA和修復(fù)模板片段，成功通過(guò)插入目標(biāo)片段編輯了玉米基因組。有的實(shí)驗(yàn)室利用離子轟擊在大豆中導(dǎo)入了Cas9、gRNA和修復(fù)模板，結(jié)果顯示其突變可遺傳后代[56]。近來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道，水稻通過(guò)HR修復(fù)方式修飾了其內(nèi)源性ALS基因，從而使其具有抗除草劑特性。發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)粒和自由雙鏈DNA形態(tài)都存在的情況下，提供HR供體能夠提高植物同源重組修復(fù)的效率。相反，單鏈寡核苷酸則不能通過(guò)提供HR供體而發(fā)揮功能[57]。最近，也有的實(shí)驗(yàn)室在擬南芥中發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)多個(gè)寡核苷酸鏈模板要比單個(gè)寡核苷酸模板具有更高的編輯效率[58]。目前，許多研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可允許多個(gè)sgRNA同時(shí)表達(dá)，對(duì)基因組同時(shí)編輯。該項(xiàng)研究在擬南芥[23]、水稻[50]及番茄[52]中均有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)在煙草[59]、擬南芥[23]、水稻[50]及番茄[52]中，多個(gè)sgRNA可以造成基因組成百上千個(gè)堿基缺失。在多倍體小麥中，Wang等[60]運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)既可同時(shí)突變多個(gè)拷貝，也能定向突變單拷貝。2013年，Shan等[61]利用 CRISPR 技術(shù)獲得了水稻OsBADH2和OsPDS基因突變體。2015年，Zhang等[35]構(gòu)建了含有Cas9和6個(gè)gRNA表達(dá)基因序列的載體，雖然編輯效率極低，但也證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠同時(shí)編輯6個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)。Wang等[62]也利用同尾酶技術(shù)和與之兼容的限制酶實(shí)現(xiàn)水稻中3個(gè)基因同時(shí)編輯。

盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠高效并多位點(diǎn)同時(shí)編輯目標(biāo)基因組，但由于其脫靶效應(yīng)可能導(dǎo)致有害突變和染色體畸形，目前CRISPR/Cas9還存在很多問(wèn)題。2015年，Ma等[28]在水稻中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因組中高GC堿基（50%～70%）含量的編輯效率相對(duì)更高，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)sgRNA中目標(biāo)配對(duì)序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成會(huì)降低基因組編輯效率。也有研究表明Cas9∶gRNA復(fù)合物能夠在較少錯(cuò)配下剪切目標(biāo)DNA序列，也就意味著該復(fù)合物也能夠剪切其他基因組位點(diǎn)[63]。有研究報(bào)道，Cas9剪切并識(shí)別特異位點(diǎn)的堿基數(shù)少于20 bp，這更增加了目標(biāo)位點(diǎn)脫靶的可能性[64]。然而，Mikami[65]和Fauser[45]等研究發(fā)現(xiàn)，在水稻和擬南芥中，Cas9的切口酶活性并不能較核酸酶活性提高NHEJ和HR的修復(fù)效率，但是能夠減少脫靶效應(yīng)。2017年，LeBlanc等[66]也發(fā)現(xiàn)，在受到熱脅迫（37℃）的擬南芥中，CRISPR誘導(dǎo)的突變頻率要比長(zhǎng)時(shí)間在標(biāo)準(zhǔn)溫度（22℃）下生長(zhǎng)的擬南芥高得多，并在柑橘中也觀察到該現(xiàn)象，這項(xiàng)研究顯示溫度在調(diào)節(jié)真核生物的Cas9活性中可能具有重要作用，并為植物中CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效率的提高提供一種簡(jiǎn)單方法。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)是生命科學(xué)在基因組編輯方面邁出的重要一步，具有廣泛的發(fā)展前景。利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)敲除不利基因，可以使作物得到精準(zhǔn)改良；利用核酸酶介導(dǎo)植物基因的替換、插入或刪除，可以使優(yōu)良基因得以穩(wěn)定遺傳等。毫無(wú)疑問(wèn)，CRISPR/Cas9是作物分子育種的重要手段。但是目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)還存在諸多亟待解決的問(wèn)題，如脫靶效率的降低問(wèn)題、真核生物的胞毒性問(wèn)題、目標(biāo)位點(diǎn)范圍的控制問(wèn)題等。這些問(wèn)題還需更加深入的思考及研究。目前，解決其脫靶效應(yīng)高和同源重組（HR）編輯效率低的問(wèn)題將是實(shí)現(xiàn)我國(guó)基因精準(zhǔn)定點(diǎn)編輯路上的重要一步?？傊珻RISPR/Cas9系統(tǒng)在廣泛應(yīng)用過(guò)程中必將得到不斷改進(jìn)與完善，必將在植物遺傳育種實(shí)踐中發(fā)揮更大作用。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Kim Y G， Cha J， Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes： zinc finger fusions to Fok Ⅰ cleavage domain[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1996， 93（3）： 1156-1160.

[2] Christian M， Cermak T， Doyle E L， et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases[J]. Genetics， 2010，186（2）： 757-761.

[3] Symington L S ， Gautier J. Double-strand break end resection and repair pathway choice[J]. Annu. Rev. Genet.， 2011， 45： 247-271.

[4] Ramirez C L， Foley J E， Wright D A， et al. Unexpected failure rates for modular assembly of engineered zinc fingers[J]. Nature Methods， 2008， 5（5）： 374-375.

[5] Hwang W Y， Fu Y， Reyon D， et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system[J]. Nature Biotechnology， 2013， 31（3）： 227-229.

[6] Doudna J A， Sontheimer E J. The use of CRISPR/Cas9， ZFNs， and TALENs in generating site-specific genome alterations [J]. Methods Enzymol.， 2014， 546：76-549.

[7] Bortesi L， Fischer R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond[J]. Biotechnology Advances， 2015， 33（1）： 41-52.

[8] Ishino Y， Shinagawa H， Makino K， et al. Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product[J]. Journal of Bacteriology， 1987， 169（12）：5429-5433.

[9] Jansen R， Embden J D， Gaastra W， et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular Microbiology， 2002， 43（6）： 1565-1575.

[10]Pourcel C， Salvignol G，Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA， and provide additional tools for evolutionary studies[J]. Microbiology， 2005， 151（Pt 3）： 653-663.

[11]Bolotin A， Quinquis B， Sorokin A， et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats （CRISPRs） have spacers of extrachromosomal origin[J]. Microbiology， 2005， 151（Pt 8）： 2551-2561.

[12]Mojica F J， Diez-Villasenor C， Garcia-Martinez J， et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements[J]. Journal of Molecular Evolution， 2005， 60（2）： 174-182.

[13]Barrangou R， Fremaux C， Deveau H， et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science， 2007， 315（5819）： 1709-1712.

[14]Marraffini L A， Sontheimer E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA[J]. Science， 2008， 322（5909）： 1843-1845.

[15]Deltcheva E， Chylinski K， Sharma C M， et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase Ⅲ[J]. Nature， 2011， 471（7340）： 602-607.

[16]Sinkunas T， Gasiunas G， Fremaux C， et al. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system[J]. The EMBO Journal， 2011，30（7）： 1335-1342.

[17]Hale C R， Zhao P， Olson S， et al. RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex[J]. Cell， 2009， 139（5）： 945-956.

[18]Anantharaman V， Iyer L M， Aravind L. Presence of a classical RRM-fold palm domain in Thg1-type 3′-5′ nucleic acid polymerases and the origin of the GGDEF and CRISPR polymerase domains[J]. Biology Direct， 2010， 5：43.

[19]Jinek M， Chylinski K， Fonfara I， et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science， 2012， 337（6096）： 816-821.

[20]Gasiunas G， Barrangou R， Horvath P， et al. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2012， 109（39）： E2579- E2586.

[21]Hsu L I， Chen C J. Hsu and Chen respond to "implications for prevention and future research"[J]. American Journal of Epidemiology， 2013， 177（3）： 217-218.

[22]Belhaj K， Chaparro-Garcia A， Kamoun S， et al. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9[J]. Current Opinion in Biotechnology， 2015， 32： 76-84.

[23]Li J F， Norville J E， Aach J， et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9[J]. Nature Biotechnology， 2013， 31（8）： 688-691.

[24]Shan Q， Wang Y， Li J， et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J]. Nature Biotechnology， 2013， 31（8）： 686-688.

[25]Nishimasu H， Ran F A， Hsu P D， et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA[J]. Cell， 2014， 156（5）： 935-949.

[26]Xie K， Minkenberg B， Yang Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2015， 112（11）： 3570-3575.

[27]Mao J， Lv J， Miao Y， et al. Development of a rapid and efficient method for non-lethal DNA sampling and genotyping in scallops[J]. PLoS One， 2013， 8（7）： e68096.

[28]Ma X， Zhang Q， Zhu Q， et al. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient， high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J]. Molecular Plant， 2015， 8（8）： 1274-1284.

[29]Jiang W， Zhou H， Bi H， et al. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis， tobacco， sorghum and rice[J]. Nucleic Acids Research， 2013， 41（20）： e188.

[30]Svitashev S， Young J K， Schwartz C， et al. Targeted mutagenesis， precise gene editing， and site-specific gene insertion in maize using Cas9 and guide RNA[J]. Plant Physiology， 2015， 169（2）： 931-945.

[31]Yu N， Cai W J， Wang S， et al. Temporal control of trichome distribution by microRNA156-targeted SPL genes in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Cell， 2010， 22（7）： 2322-2335.

[32]Zhao L L， Liu H C， Sun Q， et al. Identification of mutations conferring streptomycin resistance in multidrug-resistant tuberculosis of China[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease， 2015， 83（2）： 150-153.

[33]Mao Y， Zhang H， Xu N， et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants[J]. Molecular Plant， 2013， 6（6）： 2008-2011.

[34]Yan L， Wei S， Wu Y， et al. High-efficiency genome editing in Arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system[J]. Molecular Plant， 2015， 8（12）： 1820-1823.

[35]Zhang Z， Mao Y， Ha S， et al. A multiplex CRISPR/Cas9 platform for fast and efficient editing of multiple genes in Arabidopsis[J]. Plant Cell Reports， 2016， 35（7）： 1519-1533.

[36]Engler C， Kandzia R， Marillonnet S. A one pot， one step， precision cloning method with high throughput capability[J]. PLoS One， 2008， 3（11）： e3647.

[37]Ferreira R， Skrekas C， Nielsen J， et al. Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae[J]. ACS Synthetic Biology， 2017， 619/620：587-599.

[38]Nekrasov V， Staskawicz B， Weigel D， et al. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease[J]. Nature Biotechnology， 2013， 31（8）： 691-693.

[39]Feng Z， Mao Y， Xu N， et al. Multigeneration analysis reveals the inheritance， specificity， and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2014， 111（12）： 4632-4637.

[40]Tang L， Mao B， Li Y， et al. Knockout of OsNramp5 using the CRISPR/Cas9 system produces low Cd-accumulating indica rice without compromising yield[J]. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 14438-14450.

[41]Wang Y， Cheng X， Shan Q， et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew[J]. Nature Biotechnology， 2014， 32（9）： 947-951.

[42]Liu D， Chen X， Liu J， et al. The rice ERF transcription factor OsERF922 negatively regulates resistance to Magnaporthe oryzae and salt tolerance[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（10）： 3899-3911.

[43]Zhang J， Zhang H， Botella J R， et al. Generation of new glutinous rice by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the Waxy gene in elite rice varieties[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2017： 10.1111/jipb.12620.

[44]Gao Y， Zhang Y， Zhang D， et al. Auxin binding protein 1 （ABP1） is not required for either auxin signaling or Arabidopsis development[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2015， 112（7）： 2275-2280.

[45]Fauser F， Schiml S，Puchta H. Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal， 2014， 79（2）： 348-359.

[46]Feng Z， Zhang B， Ding W， et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system[J]. Cell Research， 2013， 23（10）： 1229-1232.

[47]Gao J， Wang G， Ma S， et al. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum[J]. Plant Molecular Biology， 2015， 87（1/2）： 99-110.

[48]Liang Z， Zhang K， Chen K， et al. Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2014， 41（2）： 63-68.

[49]Miao J， Guo D， Zhang J， et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system[J]. Cell Researsh， 2013， 23（10）： 1233-1236.

[50]Zhang H， Zhang J， Wei P， et al. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation[J]. Plant Biotechnology Journal， 2014， 12（6）： 797-807.

[51]Xu R， Li H， Qin R， et al. Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice[J]. Rice， 2014， 7：5.

[52]Brooks C， Nekrasov V， Lippman Z B， et al. Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated9 system[J]. Plant Physiol.， 2014， 166（3）： 1292-1297.

[53]Cermak T， Baltes N J， Cegan R， et al. High-frequency， precise modification of the tomato genome[J]. Genome Biology， 2015， 16：232-245.

[54]Endo M， Nishizawa-Yokoi A， Toki S. Targeted mutagenesis in rice using TALENs and the CRISPR/Cas9 system[J]. Methods in Molecular Biology， 2016， 1469： 123-135.

[55]Schiml S， Fauser F， Puchta H. The CRISPR/Cas system can be used as nuclease for in planta gene targeting and as paired nickases for directed mutagenesis in Arabidopsis resulting in heritable progeny[J]. The Plant Journal， 2014， 80（6）：1139-1150.

[56]Li Z， Liu Z B， Xing A， et al. Cas9-guide RNA directed genome editing in soybean[J]. Plant Physiology， 2015， 169（2）： 960-970.

[57]Sun Y， Zhang X， Wu C， et al. Engineering herbicide-resistant rice plants through CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination of acetolactate synthase[J]. Molecular Plant， 2016， 9（4）： 628-631.

[58]Sauer N J， Narvez-Vsquez J， Mozoruk J， et al. Oligonucleotide-mediated genome editing provides precision and function to engineered nucleases and antibiotics in plants[J]. Plant Physiol.， 2016， 170（4）： 1917-1928.

[59]Belhaj K， Chaparro-Garcia A， Kamoun S， et al. Plant genome editing made easy： targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system[J]. Plant Methods， 2013， 9（1）： 39.

[60]Wang H， Yang H， Shivalila C S， et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J]. Cell， 2013， 153（4）：910-918.

[61]Shan Q， Wang Y， Chen K， et al. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs[J]. Molecular Plant， 2013， 6（4）： 1365-1368.

[62]Wang C， Shen L， Fu Y， et al. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2015， 42（12）： 703-706.

[63]Fu Y， Foden J A， Khayter C， et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells[J]. Nature Biotechnology， 2013， 31（9）： 822-826.

[64]Fu Y， Sander J D， Reyon D， et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs[J]. Nature Biotechnology， 2014， 32（3）： 279-284.

[65]Mikami M， Toki S， Endo M. Precision targeted mutagenesis via Cas9 paired nickases in rice[J]. Plant & Cell Physiology， 2016， 57（5）： 1058-1068.

[66]LeBlanc C， Zhang F， Mendez J， et al. Increased efficiency of targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 in plants using heat stress[J]. The Plant Journal， 2017， 93： 377-386.