樊海瑞，趙　巖，傅警龍，張海波，王德超，郜玉鋼，張連學(xué)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院人參工程技術(shù)研究中心，吉林 長(zhǎng)春130118；2. 吉林省長(zhǎng)春市長(zhǎng)中風(fēng)濕骨病醫(yī)院風(fēng)濕科，吉林 長(zhǎng)春130000)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis,GA)是機(jī)體嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致尿酸(uric acid，UA)增加或排泄減少使尿酸鹽結(jié)晶沉積于軟骨、滑膜和關(guān)節(jié)囊引發(fā)關(guān)節(jié)與周?chē)浗M織發(fā)生的病理變化與炎癥反應(yīng)[1]，若不及時(shí)進(jìn)行正確的治療會(huì)使關(guān)節(jié)嚴(yán)重受損甚至導(dǎo)致殘疾[2]。隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們飲食結(jié)構(gòu)的變化,痛風(fēng)的患病率呈逐年上升的趨勢(shì)[3]。目前用于治療痛風(fēng)的藥物主要有秋水仙堿、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)抑制劑、非甾體抗炎藥(NSAIDs)、促腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)(ACTH)和皮質(zhì)類(lèi)固醇類(lèi)等。此類(lèi)藥物雖作用迅速、效果明顯，但患者需長(zhǎng)期使用且常伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)[4-5]，如秋水仙堿具有惡心、腹瀉等不良反應(yīng)；非甾體抗炎藥會(huì)導(dǎo)致腎損傷或胃腸道潰瘍、出血等，IL-1β抑制劑有加重痛風(fēng)癥狀的危險(xiǎn)[6-7]。由于以上不良反應(yīng)，臨床遇到對(duì)各種藥物使用的限制問(wèn)題。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療疾病方面具有不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，因此開(kāi)發(fā)治療痛風(fēng)中藥是目前亟待解決的問(wèn)題。我國(guó)研究人員[8-13]在創(chuàng)建相關(guān)模型、藥物療效等領(lǐng)域做了大量研究，并且已證實(shí)中藥具有治療痛風(fēng)及其并發(fā)癥的效果。

TFN組方為長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)風(fēng)濕醫(yī)院臨床多年應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)方，在臨床上使用十余年[14]。本研究探討不同劑量TFN對(duì)尿酸鈉誘導(dǎo)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療作用與作用機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用TFN提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器SD雄性大鼠，體質(zhì)量為(200±10) g，由吉林省長(zhǎng)春市生物制品研究所有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)2011-0003。痛風(fēng)寧膠囊(TFN)(組方由土茯苓、澤蘭、蠶砂、黃柏、大黃和金錢(qián)草等21味中藥組成；口服制劑，由吉林省長(zhǎng)春市長(zhǎng)中風(fēng)濕骨病醫(yī)院提供，規(guī)格：0.5 g；批準(zhǔn)文號(hào)：吉藥制字Z2007A050)。秋水仙堿(規(guī)格：0.5 mg，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20113208)，廣東彼迪藥業(yè)有限公司。尿酸鈉(U2875-5G，美國(guó)Sigma公司)。UA、一氧化氮(NO)、IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α) 等ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)，其他試劑均為分析純。分析天平(ABS 320-4N型)(上海島韓實(shí)業(yè)有限公司),酶標(biāo)儀K[SPECTRAMAX 190，美谷分子儀器(上海)有限公司],CT14D臺(tái)式高速離心機(jī)(天美科學(xué)儀器有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備[15-17]和分組取48只健康大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為6組，即空白組，模型組，秋水仙堿陽(yáng)性藥對(duì)照組，低、中和高劑量TFN組；每組8只。將大鼠仰臥固定于解剖板，右后肢小腿踝關(guān)節(jié)經(jīng)醫(yī)用酒精消毒后，用6號(hào)注射針以踝關(guān)節(jié)外側(cè)為穿刺點(diǎn)，針口斜面朝上且與脛骨成45°刺入踝關(guān)節(jié)腔，有落空感。注入250 mg·mL-1尿酸鈉溶液0.2 mL，踝關(guān)節(jié)對(duì)側(cè)鼓起視為注射成功。除空白對(duì)照組注射等體積的無(wú)菌生理鹽水外，其他各組均注射0.2 mL上述尿酸鈉溶液。制作大鼠急性GA模型。

1.3給藥方式大鼠每天上午灌胃給藥，根據(jù)人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥量的劑量換算[18]，低、中和高劑量TFN組給藥劑量分別為100、200和550 mg·kg-1。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌服秋水仙堿0.63 mg·kg-1。其他組灌胃蒸餾水。連續(xù)給藥9 d，第7天 給藥30 min后按上述1.2法造模。

1.4檢測(cè)方法和觀察指標(biāo)[19-20]造模后2、4、6和8 h用寬度為1 cm紙條測(cè)量每組大鼠踝關(guān)節(jié)同一部位周長(zhǎng)(單位mm，記號(hào)筆標(biāo)記)，計(jì)算腫脹度。腫脹度=(造模后踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)-造模前踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng))/造模前踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)第9天 給藥30 min后，將每組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后固定于解剖板，取腹主靜脈血，一部分置于采血管檢測(cè)血液中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞(1×10-9L-1)。另一部分置于離心管放置室溫下1 h后離心(3 500 r·min-1，12 min)取上清，在-70℃條件下凍存待測(cè)UA和NO水平。取血之后處死大鼠，置于冰凍干燥托盤(pán)內(nèi)，快速分離踝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織、關(guān)節(jié)液于勻漿管內(nèi)離心取上清，放置在-20℃保存，待測(cè)IL-1β、TNF-α及NO水平。以上UA、NO、IL-1β和TNF-α等指標(biāo)均按試劑盒說(shuō)明書(shū)采用酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠在0～8 h內(nèi)踝關(guān)節(jié)腫脹度明顯升高(P<0.01)，表明大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎造模成功。與模型組比較，陽(yáng)性藥對(duì)照組和高劑量TFN給藥組大鼠在2～8 h踝關(guān)節(jié)腫脹度明顯降低(P<0.05或P<0.01)，在4 h時(shí)效果最為顯著(P<0.01)。低和中劑量TFN組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度亦降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。TFN量效之間符合正態(tài)分布。

表1各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度

GroupDose(mg·kg-1)Degreeofjointswelling(t/h)　02468Blankcontrol00．19±0．030．21±0．040．22±0．050．23±0．060．21±0．05Model00．26±0．06?0．32±0．07?0．36±0．07?0．39±0．07?0．44±0．09?Positivedrugcontrol0．630．21±0．04△0．24±0．04△△0．29±0．05△0．33±0．06△0．34±0．06△△TFN　Lowdose1000．25±0．060．31±0．050．35±0．060．37±0．060．38±0．06　Middledose2000．24±0．050．28±0．060．34±0．050．36±0．060．37±0．05　Highdose5500．21±0．04△0．25±0．05△0．28±0．05△△0．34±0．04△0．35±0．06△△

*P<0.01vsblank control group；△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

2.2各組大鼠全血中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞水平與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞水平有明顯升高的趨勢(shì)；與模型組比較，陽(yáng)性藥對(duì)照組和高劑量TFN組大鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)；中劑量TFN組大鼠白細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)，但淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)表2。TFN量效之間符合正態(tài)分布。

2.3各組大鼠血清UA和NO水平與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清UA水平明顯升高(P<0.01)，NO水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性藥對(duì)照組和高劑量TFN組大鼠血清中UA水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，NO水平明顯升高(P<0.05)。低和中劑量TFN組較模型組雖有改善，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。TFN量效之間符合正態(tài)分布。

表2各組大鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量

Tab.2Number of WBC， lymphocytes and neutrophils of rats in various groups

GroupDose(mg·kg-1)WBCLymphocyteNeutrophilBlankcontrol07．76±0．8161．45±8．2616．95±2．43Model015．91±3．83??75．86±8．95?21．23±4．37?Positivedrugcontrol0．6311．46±2．54△63．48±7．77△17．54±3．71△TFN　Lowdose10014．08±3．3772．53±8．9924．14±3．21　Middledose20012．05±3．16△71．26±9．0221．05±2．81　Highdose55011．70±3．09△64．40±7．05△17．33±3．82△

*P<0.05,**P<0.01vsblank control group；△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

表3各組大鼠血清中UA和NO水平

GroupDose(mg·kg-1)UA[ρB/(g·L-1)]NO[cB/(μmol·L-1)]Blankcontrol09．55±2．0036．85±5．26Model018．12±2．33?25．14±4．22?Positivedrugcon?trol0．6311．82±2．55△32．19±5．11△TFN　Lowdose10017．12±1．8427．75±3．13　Middledose20016．70±1．8427．24±5．78　Highdose55012．57±2．16△31．64±4．01△

*P<0.01vsblank control group；△P<0.01vsmodel group.

2.4各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織和關(guān)節(jié)液中炎癥因子及NO水平與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)組織和關(guān)節(jié)液中NO、炎癥因子TNF-α和IL-1β水平均明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性藥對(duì)照組和高劑量TFN組NO、炎癥因子TNF-α和IL-1β水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。低和中劑量TFN組較模型組NO、TNF-α和IL-1β水平有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。TFN量效之間符合正態(tài)分布。

表4各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織和關(guān)節(jié)液中炎癥因子和NO水平

GroupDose(mg·kg-1)TNF?α[ρB/(ng·L-1)]IL?1β[cB/(μmol·L-1)]NO[cB/(μmol·L-1)]Blankcontrol0267．15±30．5821．34±4．3614．00±1．99Model0342．07±41．24?38．08±4．00?29．70±3．02?Positivedrugcontrol0．63286．47±38．00△△26．86±3．05△△19．68±2．01△△TFN　Lowdose100337．48±47．2536．40±5．5527．12±4．72　Middledose200327．42±44．3834．95±5．1125．30±3．99△　Highdose550289．60±37．91△△27．32±4．03△△20．86±4．21△△

*P<0.01vsblank control group；△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

3　討　論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向大鼠關(guān)節(jié)腔注入尿酸鈉建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，此法由于效率高且其病理表現(xiàn)與臨床極為相似，已被作為經(jīng)典的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎造模法。導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎臨床特征的原因之一是由于尿酸鈉(monosodium urate,MSU)沉積產(chǎn)生了大量的NO。研究[3,21]顯示：TNF-α和IL-1β為前炎癥網(wǎng)鏈內(nèi)一級(jí)細(xì)胞因子，其存在使炎癥惡化，釋放大量的炎癥物質(zhì)導(dǎo)致軟骨基質(zhì)和骨的破損。中醫(yī)藥在治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎上具有標(biāo)本兼治的特點(diǎn)，且中藥復(fù)方聯(lián)合用藥具有增效和減毒的優(yōu)勢(shì)[22-24]。因此研究與開(kāi)發(fā)具有痛風(fēng)治療效果的中藥復(fù)方具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示：TFN不僅可以降低UA水平，還能夠降低TNF-α和IL-1β水平，升高血清NO水平，降低組織中NO水平及血清UA水平，可以減小急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度，且與劑量呈正相關(guān)關(guān)系，高劑量組效果最顯著。

綜上所述，TFN治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制可能與抑制炎癥因子的釋放和降低血液中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量有關(guān)聯(lián)。而且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在治療過(guò)程中無(wú)不良反應(yīng)出現(xiàn)。TFN為長(zhǎng)中風(fēng)濕骨病醫(yī)院臨床多年應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)方，在臨床上使用十余年，但是對(duì)于其藥理活性缺乏研究。組方中藥物含有豐富的生物堿及黃酮類(lèi)等化合物，且生物堿、黃酮類(lèi)化合物如槲皮素、山奈酚、木犀草素和桑色素等對(duì)痛風(fēng)有重要作用[25]，因此本研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步探討TFN治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的療效具有重要意義。

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