朱　博，滿枋霖，劉　鵬，佟海濱，田　丹， 孫　新

(1.北華大學(xué)生命科學(xué)研究中心，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，吉林 吉林 132011)

近三十年來我國(guó)男性的生育能力呈逐年下降趨勢(shì)，男性生育能力下降及男性不育發(fā)病率增加的原因，除了遺傳因素、性腺感染、獲得性睪丸損傷及免疫性因素等明確原因外，約70%的男性不育病因未明確，有研究者[1-2]認(rèn)為導(dǎo)致男性精液質(zhì)量下降的主要原因是近年來工業(yè)化帶來的不良影響。近年來室內(nèi)裝修引起的室內(nèi)空氣污染問題越來越多地引起了人們的普遍關(guān)注，甲醛是一種常見的室內(nèi)空氣污染物，室內(nèi)裝修用的膠合板等人造板材、絕緣保溫材料以及為了提高粘合度不可避免地釋放一些甲醛[3-4]。在室內(nèi)環(huán)境中苯和苯系物是各種油漆和溶劑型涂料(如聚氨脂樹脂等)的添加劑、稀釋劑[5]。一些防水材料及家具中多使用氨水作為添加劑和增白劑；氨類物質(zhì)也存在于混凝土中，隨著溫度、濕度等環(huán)境因素變化而還原成氨氣從混凝土中慢慢釋放出來，導(dǎo)致室內(nèi)空氣中氨濃度不斷增高，形成氨氣污染[6]。研究[7]顯示：暴露于甲醛環(huán)境中雄性小鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中睪丸激素(StAR、P450scc和3β-HSD)的表達(dá)受到抑制，從而抑制了小鼠的性功能和精子發(fā)生。Naghdi等[8]研究發(fā)現(xiàn)：甲醛對(duì)雄鼠附睪尾部精子造成嚴(yán)重?fù)p傷，包括明顯增加非運(yùn)動(dòng)精子的百分比以及降低性成熟系數(shù)。

目前的研究主要集中在甲醛等單一揮發(fā)性污染物對(duì)雄鼠生殖系統(tǒng)及生殖功能的影響方面，然而在新裝修室內(nèi)甲醛伴隨著其他揮發(fā)性污染物共同存在，因此本研究采用甲醛、二甲苯和氨復(fù)合氣體(formaldehyde,xylene and ammonia，F(xiàn)XA)模擬室內(nèi)裝修主要揮發(fā)性污染物環(huán)境，探討其與雄鼠不育的關(guān)系。本研究通過雄性小鼠靜式染毒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，初步闡明裝修污染與雄性小鼠精子質(zhì)量的關(guān)系，尤其是與雄鼠少精癥和弱精癥的關(guān)系，在此基礎(chǔ)上分析其可能的機(jī)制。本研究旨在為探索構(gòu)建有益于人類健康的生活空間提供有利的依據(jù)，并為裝修污染物導(dǎo)致男性不育的治療藥物的開發(fā)提供新的靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器健康清潔級(jí)ICR雄性小鼠20只，購(gòu)于吉林省長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)-2011-0004，7周齡，體質(zhì)量(20±2)g。飼養(yǎng)于北華大學(xué)生命科學(xué)中心動(dòng)物房，環(huán)境溫度為(23±3)℃，相對(duì)濕度為35%～55%，每天12 h日光與12 h黑暗交替，清潔衛(wèi)生按本實(shí)驗(yàn)室相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程要求進(jìn)行。Caspase-9抗體、Cleaved-Caspase-3抗體和β-Actin抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，Goat anti-Mouse IgG(HRP)第二抗體和Goat anti-Rabbit IgG(HRP)第二抗體購(gòu)于美國(guó)ProteinTech公司。CX31生物顯微鏡和CX21FS1光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，WLJY-9000精子質(zhì)量分析儀(北京偉力公司)，F(xiàn)ACS Aria流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組將20只ICR雄性小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(染毒組)和對(duì)照組(未染毒組)，每組10只，采用3%～5%苦味酸(黃色)在小鼠背部皮毛上染色標(biāo)記，將每只小鼠標(biāo)號(hào)。于2個(gè)鼠籠分別飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲食。

1.3染毒方法裝修后室內(nèi)揮發(fā)性有機(jī)污染物甲醛、二甲苯和氨復(fù)合氣體濃度分別波動(dòng)于0.1～4.0 mg·m-3、0.05～5.00 mg·m-3和≤0.4 mg·m-3[9]。由于考慮到種系差異系數(shù)和接觸作用時(shí)間及空間的差異，將參考文獻(xiàn)[9]結(jié)果中濃度最大值的100倍設(shè)為實(shí)驗(yàn)組染毒濃度。甲醛、二甲苯和氨復(fù)合氣體濃度分別為60、50和40 mg·m-3。根據(jù)染毒濃度、受試物比重及染毒柜的容積采用下列公式計(jì)算出加入液態(tài)受試物的量。M= n×L/100×ρ。公式中：n表示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)受試物量(mg·L-1)，L表示染毒柜容積(L)，ρ表示受試物密度，M表示應(yīng)加入受試物的量(mL)。將得到的濃度換算整理后，甲醛、二甲苯和氨復(fù)合氣體的使用量分別為28、29和22 μL·m-3。自制硬質(zhì)塑料透明染毒柜(正在申報(bào)專利)，容積為50 L，適用于10只小鼠2 h呼吸量。將實(shí)驗(yàn)組小鼠逐一放入染毒柜中，分別取甲醛、二甲苯和氨于燒杯中，將燒杯置于染毒柜進(jìn)行受試物的混配吸入染毒，每天密閉靜式染毒2 h，小鼠染毒期間禁食水，其余時(shí)間自由飲食；同時(shí)對(duì)照組小鼠每天放于充滿空氣的受試物染毒柜中，每天密閉2 h，期間禁食水，其余時(shí)間自由飲食。35 d后處死，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4小鼠行為學(xué)觀察染毒期間，每天觀察并記錄小鼠的外觀特征、毛發(fā)光亮程度、食水量、行為、大小便及中毒情況。觀察小鼠是否有籠頂爬行、懸掛、后翻和高跳等異常行為。

1.5小鼠體質(zhì)量觀察染毒期間每天固定時(shí)間(16:00)稱小鼠體質(zhì)量，記錄其體質(zhì)量增長(zhǎng)情況，以染毒第1天的體質(zhì)量增長(zhǎng)率為0.00%，分別計(jì)算對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每7 d的體質(zhì)量增長(zhǎng)率。第n個(gè)7 d體質(zhì)量增長(zhǎng)率=[第n個(gè)7 d的體質(zhì)量-第(n-1)個(gè)7 d的體質(zhì)量]/[第(n-1)個(gè)7 d的體質(zhì)量]×100%。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組雄性小鼠每7 d的平均體質(zhì)量增長(zhǎng)率可說明2組小鼠體質(zhì)量差異及染毒期間雄性小鼠體質(zhì)量變化情況。

1.6小鼠精子濃度、活力和畸形率測(cè)定染毒35 d后，小鼠頸椎脫臼處死，固定于鼠板，75%乙醇消毒小鼠下腹部，剖開腹腔，取出睪丸及附睪，剔除周邊筋膜組織，生理鹽水漂洗，濾紙吸干，準(zhǔn)確稱量附睪質(zhì)量，置于1 mL、37℃預(yù)熱的PBS中，用眼科剪將附睪剪碎，放置于37℃恒溫箱靜置15 min，待精子游離出來，300目尼龍網(wǎng)過濾入1.5 mL EP管中。然后取10 μL精子懸液置于精子計(jì)數(shù)板，用精子質(zhì)量分析儀進(jìn)行分析，并記錄精子密度和活力[10]。根據(jù)Cooper等[10]提供的小鼠精子畸形率判定標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算精子畸形率。精子畸形率=(畸形精子數(shù))/(計(jì)數(shù)精子總數(shù))×100%。

1.7小鼠精子凋亡率測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各取3只小鼠，按1.6分別制作精子懸液，然后用PBS(4℃預(yù)冷)調(diào)整精子濃度為2×106mL-1。取1 mL精子懸液，預(yù)冷PBS洗滌，離心(300 g，10 min)，棄上清重復(fù)2次，加入1 mL Annexin Ⅴ Binding Buffer 重懸混勻，取出100 μL放入EP管中，加入FITC-Annexin Ⅴ 5 μL和PI 10 μL染色，室溫下避光15 min后加入400 μL孵育緩沖液，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果以細(xì)胞凋亡率表示。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。每組做3次平行試驗(yàn)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8Western blotting法檢測(cè)睪丸組織中Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白水平按照上述步驟解剖小鼠，取出睪丸組織，提取小鼠睪丸組織總蛋白。在96孔板中依次加入不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品10 μL，再加入200 μL BCA工作液，將酶標(biāo)板放在振蕩器上震蕩30 s，37℃孵育15 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm處波長(zhǎng)的吸光度(A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

Western blotting法參照Sun等[11]的實(shí)驗(yàn)方法。一抗：分別用Caspase-9抗體、Cleaved Caspase-3抗體和β-actin抗體。二抗：Goat anti-Rabbit IgG抗體。對(duì)電泳條帶采用Image J軟件進(jìn)行灰度值掃描，與β-actin條帶進(jìn)行對(duì)比獲得各自蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，并對(duì)各目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

2　結(jié)　果

2.12組小鼠的行為學(xué)染毒開始，實(shí)驗(yàn)組小鼠受到FXA的刺激有明顯的抓耳、搔鼻現(xiàn)象，并且有興奮(跳躍、躁動(dòng)不安)及多動(dòng)行為；30 min后大多數(shù)小鼠表現(xiàn)為直立、持續(xù)跳動(dòng)和狂躁等行為，個(gè)別小鼠出現(xiàn)神經(jīng)刺激癥狀，但無死亡與中毒現(xiàn)象；1 h后小鼠基本處于抑制狀態(tài)(群居和少動(dòng))，出現(xiàn)皮毛蓬松和稀便等癥狀。對(duì)照組小鼠未受到受試物的刺激，小鼠表現(xiàn)為眺望、修飾、游走和探究等正常行為。

2.22組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠在染毒后的第1周(0～7 d)、第2周(8～14 d)、第3周(15～21 d)和第4周(22～28 d)小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢(P<0.05)；在染毒的第5周(29～35 d)2組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.32組小鼠精子濃度、活力和畸形率實(shí)驗(yàn)組小鼠精子濃度、活力及畸形率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。染毒35 d后，取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠附睪精子，精子濃度分別為(28.03±2.03)×106mL-1和(20.23±1.96)×106mL-1，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；精子活力分別為(62.70±4.00)%和(38.24±8.03)%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；精子畸形率分別為(31.21±6.61)%和(24.20±4.29)%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組小鼠精子中出現(xiàn)斷頭精子比率明顯多于對(duì)照組。見圖1。

表12組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率

GroupIncreaserateofbodyweight1-7d8-14d15-21d22-28d29-35dControl20．04±4．9913．09±4．5612．26±3．0011．29±2．268．08±2．17Experimental9．09±2．97?6．85±0．75?7．63±1．78?7．99±1．42?6．54±1．40

*P<0.05 compared with control group.

A: Control group; B: Experimental group.

Fig.1Morphology of epididymal sperms of mice in two groups

2.42組小鼠附睪中精子凋亡率染毒35 d后實(shí)驗(yàn)組小鼠附睪精子凋亡率(53.95%±0.57%)明顯高于對(duì)照組(1.03%±0.01%)(P<0.01)。見圖2。

A: Control group; B: Experimental group.

Fig.2Apoptosis of epididymal sperms of mice in two groups

2.52組小鼠睪丸組織中Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組Caspase-9蛋白和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，內(nèi)參蛋白β-actin表達(dá)量基本相同。見圖3。通過Image J軟件進(jìn)行灰度分析結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組Caspase-9蛋白表達(dá)水平(45.73±1.47)與對(duì)照組(47.11±4.98)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)條帶很淺，幾乎無表達(dá)(4.22±0.20vs4.18±1.33)。

Lane 1:Control group;Lane 2:Experimental group.

圖32組小鼠睪丸組織中Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.3Electrophoregram of expressions of Caspase-9 and Cleaved Caspase-3 proteins in testis tissue of mice in two groups

3　討　論

人類處于室內(nèi)環(huán)境的時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)生命的87%[12]，而老弱病殘者、孕產(chǎn)婦和嬰幼兒等敏感人群在室內(nèi)的時(shí)間更長(zhǎng)，因此室內(nèi)環(huán)境的居住質(zhì)量直接影響著人類的學(xué)習(xí)與工作，關(guān)系著人類的生存與健康。近年來，由于含有能夠揮發(fā)出有害化學(xué)物質(zhì)的建筑、人造板裝飾及家具材料的大量使用使得室內(nèi)環(huán)境的污染日益嚴(yán)重[13]。民居中常見且被大家熟知的室內(nèi)揮發(fā)性有機(jī)物主要有甲醛、苯及苯系物和氨。企業(yè)在生產(chǎn)人造板材過程中使用以甲醛為主要成分的脲醛樹脂膠黏劑，板材中殘留的和未參與反應(yīng)的甲醛會(huì)逐漸向周圍環(huán)境釋放，導(dǎo)致室內(nèi)環(huán)境空氣污染嚴(yán)重。甲醛釋放期：一般板材(夾芯板)3～5 年；人造密度板(高密纖維板)則長(zhǎng)達(dá)15 年[14]；在室內(nèi)環(huán)境中苯和苯系物是各種油漆和溶劑型涂料的添加劑、稀釋劑[5]；一些防水材料及家具中多使用氨水作為添加劑和增白劑，另外混凝土的防凍劑、高堿混凝土膨脹劑和早強(qiáng)劑中多使用氨水作為添加劑[6]。新房裝修后，甲醛以很高的濃度共存于室內(nèi)，可能對(duì)暴露人群發(fā)揮著聯(lián)合毒性效應(yīng)[14-15]。

本研究結(jié)果顯示：染毒開始受到甲醛、二甲苯及氨刺激的實(shí)驗(yàn)組小鼠有明顯的抓耳、搔鼻且有興奮(跳躍、躁動(dòng)不安)及多動(dòng)行為。30 min后大多數(shù)小鼠表現(xiàn)為直立、持續(xù)跳動(dòng)和狂躁等行為，但無死亡與中毒現(xiàn)象。1 h后基本處于抑制狀態(tài)(群居和少動(dòng))，出現(xiàn)皮毛蓬松、稀便等癥狀。對(duì)照組小鼠未受到受試物的刺激，小鼠表現(xiàn)為眺望、修飾、游走和探究等正常行為。此類不良反應(yīng)可能是由受試物刺激小鼠呼吸道導(dǎo)致的呼吸道黏膜刺激癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)刺激癥狀所致。

目前關(guān)于室內(nèi)揮發(fā)性污染物的生殖發(fā)育毒性的研究主要是研究單一毒物的作用，各種污染物的聯(lián)合生殖與發(fā)育毒性研究相對(duì)較少，這與現(xiàn)實(shí)人群聯(lián)合暴露的實(shí)際環(huán)境不相符合。因此本實(shí)驗(yàn)以3種主要室內(nèi)裝修污染物模擬裝修污染內(nèi)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：染毒28 d后室內(nèi)裝修污染物能夠明顯抑制雄性小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)，降低雄性小鼠附睪尾部精子數(shù)量和活力、增加雄性小鼠附睪尾部精子畸形率，同時(shí)導(dǎo)致雄性小鼠附睪尾部精子凋亡率增加。本研究結(jié)果顯示：本實(shí)驗(yàn)所用的染毒劑量和暴露時(shí)間，未造成雄性小鼠睪丸組織中凋亡蛋白Caspase-9和Cleaved Caspase-3表達(dá)變化。鄒學(xué)敏等[14]研究發(fā)現(xiàn)：苯與甲醛聯(lián)合染毒可觀察到睪丸組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)曲細(xì)精管形態(tài)不規(guī)則，邊緣極度不完整，各級(jí)精母細(xì)胞有不同程度的變性、缺失和管腔發(fā)育成熟的精子明顯減少等病變?？紤]本實(shí)驗(yàn)可能是由于染毒劑量小、染毒時(shí)間短，尚未引起睪丸組織中凋亡相關(guān)因子改變。另一方面，室內(nèi)裝修主要污染物損傷雄鼠附睪精子，但其睪丸組織未發(fā)生損傷時(shí)，若及時(shí)脫離污染環(huán)境是否會(huì)使雄鼠附睪精子質(zhì)量得以恢復(fù)有待于進(jìn)一步深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李裕民,韓云賢,羅志彬.男性不育與生活環(huán)境[J].中外醫(yī)學(xué)研究,2011,9(32): 152-156.

[2] 汪瑤瑤,曾向陽,孫建明.精子DNA損傷在男性不育癥中的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志,2014,19(6):419-422.

[3] Bob M,Stephen E,David L,et al.Bob M,Stephen E,David L,et al.Committee on the medical effects of air pollutants(Comeap): handbook on air pollution and health[M].London:Department of Health，2010.

[4] Jurvelin J，Vartiainen M，Jantunen M，et al.Personal exposure levels and microenvironmental concentrations of formaldehyde and acetaldehyde in the Helsinki metropolitan area Finland[J].Air Waste Manag Assoc,2001，51(1):17-24.

[5] 張平.杭州市空氣中苯系物的污染特征、來源及健康風(fēng)險(xiǎn)[D].杭州：浙江大學(xué)，2007:19-36.

[6] Koistinen K,Kotzias D,Kephalopoulos S,et al.The INDEX project:executive summary of a European Union project on indoor air pollutunts[J].Allergy,2008,63(7):810-819.

[7] Zang ZJ,Fang YQ,Ji SY,et al.Formaldehyde inhibits sexual behavior and expression of steroidogenic enzymes in the testes of mice[J].J Sex Med,2017, 14(11):1297-1306.

[8] Naghdi M,Maghbool M,Seifalah-Zade M,et al.Effects of common fig (Ficus carica) leaf extracts on sperm parameters and testis of mice intoxicated with formaldehyde[J].Evid Based Complement Alternat Med,2016,2016:2539127.

[9] 劉佳.室內(nèi)空氣污染物對(duì)雌鼠生殖性能的影響[D].沈陽：東北林業(yè)大學(xué),2012.

[10]Cooper T,Castilla JA.WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen[J].Int Congress Androl,2010,30 (2) :9.

[11]Sun X,Yasuda O,Takemura Y,et al.Akt activation prevents Apop-1-induced death of cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,377(4):1097-1101.

[12]Klepeis NE,Nelson WC,Ott WR,et al.The national human activity pattern survey (NHAPS): a resource for assessing exposureto environmental pollutants[J].J Exp Anal Environ Epidemiol,2001,11(3): 231-252.

[13]Bulavka IUA.The development of a comprehensive assessment of occupational risk by taking into account the total hazard of working conditions[J].Gig Sanit,2013(4):47-54.

[14]鄒學(xué)敏,張英彪,朱樂玫，等.苯與甲醛聯(lián)合染毒對(duì)小鼠睪丸及精子的損傷作用[J].中華全科醫(yī)學(xué),2016,14(6):925-927,972.

[15]石春養(yǎng)，于萍.“甲醛-網(wǎng)凈”治理室內(nèi)空氣污染的效果探討[J].中國(guó)環(huán)境衛(wèi)生,2005,8(3/4):21-26.