富 貴,趙志剛,鄧昌蓉

(1.青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院,中國(guó)青海西寧 810007;2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,中國(guó)青海西寧 810016;3.青海省高原作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)青海西寧 810016)

蕓薹屬(Brassica)植物包含了許多經(jīng)濟(jì)上有重要價(jià)值的作物,是十字花科(Brassicaceae)植物中最為重要的屬。油菜為蕓薹屬作物,因其籽可作為食用油原料而被廣泛種植。中國(guó)是油菜種植面積最廣且產(chǎn)量最高的國(guó)家,近幾年來(lái)農(nóng)民種植油菜面積不斷擴(kuò)大。油菜種植不僅可滿(mǎn)足自家食用油的需求,而且通過(guò)出售油菜籽可增加收入,所以對(duì)于油菜產(chǎn)量提高和品質(zhì)改良的研究需不斷加強(qiáng)[1,2]。目前油菜栽培種主要有以下3種,甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)、白菜型油菜(Brassica rapa)和芥菜型油菜(Brassica juncea)。甘藍(lán)型油菜起源于歐洲,其產(chǎn)量和品質(zhì)與其他兩個(gè)栽培種相比具明顯的優(yōu)勢(shì),而且其具有高抗病、抗逆、適應(yīng)性廣等特征,因此被認(rèn)為是具有最大利用潛質(zhì)的油料作物之一,是中國(guó)栽培面積最廣的油菜類(lèi)型[3]。栽培時(shí)間較短、種質(zhì)資源少、遺傳基礎(chǔ)狹窄等因素影響了中國(guó)甘藍(lán)型油菜的育種進(jìn)展[4]。如何增加甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源,豐富甘藍(lán)型油菜遺傳多樣性,成為國(guó)內(nèi)育種專(zhuān)家急于解決的問(wèn)題之一。“禹式三角”理論,結(jié)合現(xiàn)階段分子生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)研究結(jié)果表明,甘藍(lán)型油菜(2n=38,AACC)雙親為甘藍(lán)(B.oleracea,2n=18,CC)和白菜型油菜(B.rapa,2n=20,AA),兩個(gè)二倍體親本經(jīng)過(guò)多次天然雜交,再經(jīng)染色體自然加倍逐步進(jìn)化,形成一個(gè)新的雙二倍體復(fù)合種[5]。其二倍體親本種白菜和甘藍(lán)栽培起源較早,栽種歷史久遠(yuǎn),在不同國(guó)家有多個(gè)亞種和變種,遺傳多樣性豐富,而且其產(chǎn)量性狀和品質(zhì)性狀變異廣,因此可利用現(xiàn)有甘藍(lán)和白菜型油菜優(yōu)良品種雜交,人工合成異源四倍體甘藍(lán)型油菜,從而為拓寬現(xiàn)有甘藍(lán)型油菜遺傳基礎(chǔ)開(kāi)辟一條新途徑。人工合成異源多倍體早期世代基因組結(jié)構(gòu)及表型變異豐富,遺傳不穩(wěn)定[6～9],可利用A-C基因組進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的豐富變異,篩選出新的優(yōu)良基因,使甘藍(lán)型油菜遺傳多樣性匱乏這一問(wèn)題得到有效解決。另外,蕓薹屬A-C基因組間的進(jìn)化機(jī)制及A-C基因組形成異源多倍體過(guò)程中的遺傳變異是十字花科研究的熱點(diǎn)問(wèn)題,人工合成甘藍(lán)型油菜作為一種模式生物已被廣泛使用。結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展,本文對(duì)人工合成甘藍(lán)型油菜獲得方法、后代基因組水平和表達(dá)水平遺傳變異及在育種中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 人工獲得甘藍(lán)型油菜方法的研究

1935年日本學(xué)者Nagahara[10]提出,二倍體的白菜型油菜與甘藍(lán)天然雜交自然加倍后形成了現(xiàn)在的甘藍(lán)型油菜?；诖死碚?很多學(xué)者展開(kāi)了人工雜交獲得甘藍(lán)型油菜方法的探索和研究,但是白菜型油菜和甘藍(lán)基因組結(jié)構(gòu)上存在本質(zhì)差異,屬于蕓薹屬不同栽培種,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),單純依靠有性雜交很難成功獲得預(yù)期雜種[2]。Nagahara[10]研究了蕓薹屬種間白菜型油菜與甘藍(lán)正反雜交后獲得雜種的差異,經(jīng)統(tǒng)計(jì),以白菜型油菜為母本的正交73朵花中僅有4株獲得雜種,而380朵反交的花均未得到雜種。Olsson,Nishiyama等[11,12]對(duì)甘藍(lán)×白菜型油菜雜交展開(kāi)的研究中也均未獲得雜種。不同種雜交,其親和性主要是由基因型和親緣關(guān)系決定的,而且受到親本的基因組、正反交方向及雜種培育的環(huán)境條件等諸多因素影響[13]。有學(xué)者提出十字花科屬間和種間雜交不成功的原因主要是雜交種胚發(fā)育過(guò)程中胚乳凋亡導(dǎo)致胚發(fā)育不平衡[14]。人們通過(guò)不斷探索和優(yōu)化人工合成甘藍(lán)型油菜的方法最后發(fā)現(xiàn),通過(guò)子房和胚珠體外培養(yǎng)可以極大地提高種間雜種的獲得概率,尤其是甘藍(lán)×白菜的雜交組合,其中用胚珠培養(yǎng)的方法更為有效[15,16]。早在1959年,Nishi等[17]就首次將胚搶救方法在人工合成甘藍(lán)型油菜上成功應(yīng)用。此后許多學(xué)者使用胚搶救、胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)等組培技術(shù)獲得了大量的甘藍(lán)型油菜人工合成種[18～20]。近幾年來(lái),植物組織培養(yǎng)技術(shù)不斷發(fā)展,油菜大部分種屬內(nèi)雜交都已實(shí)現(xiàn),人工合成甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源不斷被獲得[21～24]。另外,原生質(zhì)體融合技術(shù)可有效避開(kāi)有性生殖過(guò)程中的生殖隔離,極大地提高了遠(yuǎn)緣雜交的成功率,有利于促進(jìn)不同物種胞質(zhì)間基因整合與重組,這種方法在研究蕓薹屬不同基因組間進(jìn)化關(guān)系時(shí)也有應(yīng)用[25,26]。有學(xué)者利用原生質(zhì)體融合的方法成功獲得了人工合成甘藍(lán)型油菜,如R?bbelen[27]利用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得了白菜型油菜與甘藍(lán)的種間雜種,并利用該人工合成甘藍(lán)型油菜研究了甘藍(lán)型油菜的自然進(jìn)化過(guò)程。

2 人工合成甘藍(lán)型油菜的細(xì)胞遺傳學(xué)研究

2.1 人工合成甘藍(lán)型油菜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常

遠(yuǎn)緣雜交后代因?yàn)槭艿接H本基因組異質(zhì)性的沖擊,染色體在聯(lián)會(huì)的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)重排、丟失、消除等異?，F(xiàn)象,通過(guò)對(duì)這些異常染色體觀察和研究可揭示不同基因組間染色體同源性來(lái)源和發(fā)生機(jī)制。大量研究發(fā)現(xiàn),人工合成甘藍(lán)型油菜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的不同時(shí)期均有染色體異常的變化,其染色體配對(duì)并不是完全二倍體化,而是存在許多單價(jià)體和多價(jià)體。Heneen等[28]在人工合成甘藍(lán)型油菜后代花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察過(guò)程中發(fā)現(xiàn),一些細(xì)胞的染色體出現(xiàn)了六價(jià)體。張穎等[29,30]對(duì)人工合成甘藍(lán)型油菜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂不同時(shí)期均出現(xiàn)了個(gè)別染色體異常現(xiàn)象,且分裂最后染色體配對(duì)模式較為復(fù)雜。李俊等[31]也對(duì)人工合成蕓薹四倍體(AACC)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)的染色體行為進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):染色體在雙線期可聚合形成兩個(gè)具不同特征的染色體群;隨后個(gè)別二價(jià)體逐漸出現(xiàn),終變期大部分細(xì)胞形成了19個(gè)二價(jià)體,但是也有個(gè)別細(xì)胞產(chǎn)生了四價(jià)體和二價(jià)體染色體異常配對(duì)。Ohmido等[32]結(jié)合表型性狀分析了人工合成甘藍(lán)型油菜后代染色體變異,研究發(fā)現(xiàn)表型異常的植株花粉育性較差,染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)都表現(xiàn)出不穩(wěn)定性,有不完整的染色體片段出現(xiàn)。以上對(duì)人工合成甘藍(lán)型油菜細(xì)胞遺傳學(xué)的研究表明,A-C兩套不同基因組染色體可以部分配對(duì)形成多價(jià)體,說(shuō)明兩套不同染色體之間具有一定的同源性或存在某種親緣關(guān)系,染色體異常配對(duì)或結(jié)構(gòu)變異對(duì)于人工合成甘藍(lán)型油菜多倍化的穩(wěn)定是不可或缺的。

2.2 人工合成甘藍(lán)型油菜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常的原因

早期細(xì)胞學(xué)研究主要通過(guò)染色體壓片進(jìn)行,大量研究表明,蕓薹屬A-C基因組之間存在同源區(qū)域,可以進(jìn)行染色體配對(duì)。R?bbelen[33]研究蕓薹屬細(xì)胞染色體有絲分裂時(shí)發(fā)現(xiàn),基因組A、B和C二倍體可能是由同一個(gè)染色體基數(shù)為6的共同祖先進(jìn)化而來(lái)。蕓薹屬3個(gè)不同基因組中具有相似的DNA區(qū)域,而且這些相似區(qū)域在A、B、C 3個(gè)基因組的組織和分布上有一定的差異[34～38]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和研究方法的改進(jìn),如熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、原生質(zhì)體融合、分子標(biāo)記、基因芯片及高通量基因組測(cè)序等技術(shù)的應(yīng)用,對(duì)于蕓薹屬A、B、C 3個(gè)基因組的親緣關(guān)系有了進(jìn)一步的研究,以人工合成的二倍體及四倍體為材料的研究表明,相比較A-C間染色體組更多的部分同源染色體配對(duì),A-B、C-B間的非同源染色體配對(duì)發(fā)生的頻率極低[39],該結(jié)論與早期一些研究和推測(cè)[40,41]一致。A-C基因組之間的部分同源性是引起人工合成甘藍(lán)型油菜染色體異常配對(duì)的主要原因,這一結(jié)論被大量研究所證實(shí)。李俊等[31]認(rèn)為甘藍(lán)型油菜的染色體在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變異可能主要是A、C基因組加倍過(guò)程中內(nèi)部染色體間交換的結(jié)果。Prakash等[42]研究發(fā)現(xiàn),進(jìn)化過(guò)程中不同組染色體之間的交換會(huì)積累,這種不斷積累的交換最終導(dǎo)致染色體組結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變異,從而使蕓薹屬種間染色體聯(lián)會(huì)出現(xiàn)混亂。Jenczewski等[43]以幾種不同品種類(lèi)型的甘藍(lán)型油菜單倍體為研究對(duì)象,對(duì)其染色體聯(lián)會(huì)行為進(jìn)行了觀察,研究結(jié)果表明,甘藍(lán)型油菜染色體配對(duì)模式由特定基因決定,C基因組上有一個(gè)與小麥ph I相似的主效基因,定名為prBn基因。雖然該基因可以有效抑制A-C基因組間具有同源區(qū)域的染色體相互配對(duì),但這一發(fā)現(xiàn)只在甘藍(lán)型油菜單倍體中得到證實(shí)。此外,近期研究發(fā)現(xiàn):人工合成甘藍(lán)型油菜早期世代的染色體非整倍性,染色體重排及劑量補(bǔ)償效應(yīng)對(duì)人工合成種染色體數(shù)目的穩(wěn)定起到了加強(qiáng)作用[44]。

3 人工合成甘藍(lán)型油菜的分子生物學(xué)研究

異源多倍體進(jìn)化過(guò)程存在一個(gè)廣泛、迅速的二倍化時(shí)期,新生的異源多倍體在其穩(wěn)定過(guò)程中都要經(jīng)歷基因組和表觀遺傳學(xué)上快速變異過(guò)程?；蚪M水平變異主要表現(xiàn)為親本DNA序列片段消失或新片段出現(xiàn),變異的發(fā)生可能是不同染色體組同源片段不等交換引起基因重組的結(jié)果[5]。甲基化變異引起的基因沉默和激活是表達(dá)水平變異的主要方式[45～47]。高通量測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展,使得小分子RNA(small RNAs,sRNAs)的變異研究在人工合成甘藍(lán)型油菜中相繼開(kāi)展,雖然研究尚處在初級(jí)階段,但也為人工合成甘藍(lán)型油菜的遺傳變異研究提供了新思路。自然界中很多異源多倍體的親本已消亡,但人工合成甘藍(lán)型油菜雙親基因組結(jié)構(gòu)和組成是可分析的,所以其是研究異源多倍化基因組水平遺傳和表觀遺傳變異的理想材料,通過(guò)與親本比較,可對(duì)多倍體合成種基因組和基因表達(dá)水平產(chǎn)生的變異進(jìn)行分析,探索其變異發(fā)生的來(lái)源和機(jī)理[2]。

3.1 人工合成甘藍(lán)型油菜基因組遺傳變異

大量研究表明,人工合成甘藍(lán)型油菜早期世代遺傳不穩(wěn)定,不論是表型還是基因組水平都會(huì)發(fā)生變異,且基因組變異具有一定的偏向性。Song等[48]利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分子標(biāo)記方法,對(duì)蕓薹屬3個(gè)基本種相互正反雜交獲得的人工合成四倍體甘藍(lán)型油菜(AACC、CCAA)和芥菜型油菜(AABB、BBAA)進(jìn)行了分析研究,跟蹤分析了兩種不同類(lèi)型四倍體自交后代基因組遺傳變異現(xiàn)象,發(fā)現(xiàn)從自交第2代至第5代的過(guò)程中,兩個(gè)不同基因組類(lèi)型的四倍體都發(fā)生了多種類(lèi)型的變異,包括親本DNA片段的丟失、新增片段的出現(xiàn)等。Parkin等[49]利用RFLP分子標(biāo)記技術(shù),在人工合成甘藍(lán)型油菜中也發(fā)現(xiàn)了親本基因組序列類(lèi)似的變異,在人工合成種中篩選出399個(gè)多態(tài)性序列,但是有159個(gè)多態(tài)性序列無(wú)法在其二倍體親本中找到。Lukens和Gaeta等[50,51]通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)了50個(gè)不同的人工甘藍(lán)型油菜S0代株系,發(fā)現(xiàn)S0代基因組水平發(fā)生的變異很少,但是在S0自交得到的50個(gè)S5植株中有47個(gè)植株基因組序列出現(xiàn)了變異位點(diǎn),RFLP和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(sim ple sequence repeat,SSR)分子標(biāo)記分析分別檢測(cè)到33.00%和71.00%的變異位點(diǎn),究其變異的原因可能是非同源染色體之間的單向易位導(dǎo)致其大多數(shù)片段缺失。富貴[2]利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)以青海大黃油菜為母本、中花芥藍(lán)和中遲芥藍(lán)為父本的人工合成種S0和S1世代植株展開(kāi)研究發(fā)現(xiàn),S0世代發(fā)生變異的擴(kuò)增條帶占S0總條帶的1.71%,S1為0.915%。Song等[34]利用RFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)人工合成甘藍(lán)型油菜自交后代中染色體結(jié)構(gòu)上發(fā)生的改變進(jìn)行了觀察,結(jié)果顯示,合成種自交到第2代至第5代,都會(huì)出現(xiàn)一些在親本中無(wú)法找到的RFLP多態(tài)性位點(diǎn),而且這種新型變異帶型的出現(xiàn)和細(xì)胞質(zhì)核互作有關(guān)系,推測(cè)人工合成種合成初期,基因組受到異質(zhì)性沖擊導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)已經(jīng)產(chǎn)生了變化。另外,人工合成異源多倍體進(jìn)化過(guò)程中,遺傳變異發(fā)生頻率有一個(gè)遞增的趨勢(shì),究其原因,多倍化過(guò)程中染色體配對(duì)時(shí),具有部分同源區(qū)段的兩套親本染色體會(huì)發(fā)生交換,而這種錯(cuò)配的紊亂引起了染色體結(jié)構(gòu)和序列的改變,導(dǎo)致其在遺傳過(guò)程中子代染色體錯(cuò)配發(fā)生的概率進(jìn)一步增加,從而引發(fā)后代出現(xiàn)包括染色體消除與補(bǔ)償、部分同源染色體重排、序列新增和缺失等更高頻率的變異。前人將這種遺傳變異隨著世代的增高而遞增的現(xiàn)象稱(chēng)為“多倍化齒輪效應(yīng)”[52]。

3.2 甲基化及基因表達(dá)變異

甲基化是對(duì)DNA序列 5′-CCGG位點(diǎn)進(jìn)行修飾的一種表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式,它在整個(gè)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有很重要的調(diào)控作用。植物基因組甲基化研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)座子和反向轉(zhuǎn)座子序列是DNA甲基化發(fā)生的主要位點(diǎn),甲基化修飾通常表現(xiàn)為特定基因的表達(dá)和沉默[2]。前人對(duì)蕓薹屬中基因組DNA轉(zhuǎn)座子附近的甲基化模式進(jìn)行了研究,對(duì)發(fā)生甲基化的序列展開(kāi)了分析,發(fā)現(xiàn)超甲基化和去甲基化是甲基化改變的兩種模式,而且甲基化變異是可遺傳的,人工合成甘藍(lán)型油菜二倍化過(guò)程中,其后代甲基化也會(huì)表現(xiàn)出一定規(guī)律的變異[53]。相關(guān)研究對(duì)50個(gè)甘藍(lán)型油菜人工合成株系基因組甲基化變異進(jìn)行了檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)人工合成種S0代DNA上胞嘧啶甲基化變異頻繁,而且以甲基化為主,甲基化變異主要發(fā)生在A基因組上。研究還發(fā)現(xiàn),人工合成種第1代發(fā)生的甲基化變異會(huì)在第5代固定下來(lái),雖然隨著自交代數(shù)增加基因組水平變異發(fā)生頻率較高,但是甲基化水平變異趨于穩(wěn)定[50,51]。富貴[2]利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)分子標(biāo)記技術(shù),對(duì)大黃油菜×中遲芥藍(lán)人工合成種S0世代植株進(jìn)行了甲基化分析,發(fā)現(xiàn)S0植株中只有3個(gè)位點(diǎn)變異,進(jìn)一步與親本比較發(fā)現(xiàn),變異位點(diǎn)全部發(fā)生在母本基因組上,這和Lukens[50]的研究結(jié)果相似。劉紅磊[54]對(duì)羽衣甘藍(lán)和白菜型油菜雜交后代S0至S3世代轉(zhuǎn)座子側(cè)翼CCGG位點(diǎn)的胞嘧啶甲基化進(jìn)行了MSAP檢測(cè),從二倍體親本到異源四倍體人工合成甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)座子附近CCGG位點(diǎn)發(fā)生了廣泛的甲基化變異,且這種變異有一定的規(guī)律性。Ran等[55]利用MSAP和高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)技術(shù)分析了甘藍(lán)型油菜多倍化過(guò)程中DNA甲基化水平的動(dòng)態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn):F1的甲基化水平最低,為38.7%,而S1～S3世代的甲基化水平逐漸升高,最高達(dá)40.32%,與此同時(shí),DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MET(methyltransferase)和 CMT(chromomethylase)的表達(dá)也出現(xiàn)了同樣的變化趨勢(shì)。近期研究發(fā)現(xiàn),植物基因組在基因表達(dá)和轉(zhuǎn)座子沉默之間存在一種權(quán)衡關(guān)系,通過(guò)甲基化沉默轉(zhuǎn)座子通常會(huì)抑制其下游基因的表達(dá)[56～58]。

人工合成甘藍(lán)型油菜基因組不僅會(huì)發(fā)生有規(guī)律的變異,而且其后代在基因表達(dá)上也會(huì)產(chǎn)生一定變化。cDNA-AFLP技術(shù)被廣泛用于分析異源多倍體轉(zhuǎn)錄水平的變異研究。Xu等[53]以人工合成的甘藍(lán)型油菜不同生長(zhǎng)期的葉片為材料,利用cDNA-AFLP分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn):人工合成種F04J2有4.09%的條帶不同于親本擴(kuò)增帶型;不同組織器官基因表達(dá)差異不明顯,表達(dá)變異趨于發(fā)生在C基因組上,C基因組上發(fā)生的基因沉默變異比例(8.83%)較高于A基因組(3.96%)。陳新[59]應(yīng)用cDNA-AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)新合成的甘藍(lán)型油菜及其親本苗期全基因組的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),表達(dá)譜發(fā)生了比較廣泛的變異,與雙親本比較,人工合成種中存在基因激活和沉默的變異,其中激活和沉默的基因各占被檢測(cè)基因的17.0%和29.6%。鄧昌蓉等[5]以人工合成甘藍(lán)型油菜親本、S0代、S3代植株為材料,用26對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果表明,S3世代在基因組水平發(fā)生變異的擴(kuò)增條帶僅占總擴(kuò)增條帶的6.33%,但是表達(dá)水平變異為81.34%,而且變異都傾向于發(fā)生在C基因組上。由此說(shuō)明A-C基因組多倍化后基因表達(dá)水平存在一定程度的變異,變異大小及發(fā)生的偏向性因研究背景不同表現(xiàn)出差異性。另外,有研究表明,表達(dá)水平產(chǎn)生變異大小和基因組變異具有相關(guān)性,如Gaeta等[51]研究發(fā)現(xiàn),新型甘藍(lán)型油菜S0代基因組水平的變異和基因表達(dá)水平的變異沒(méi)有關(guān)系,但是對(duì)自交第5代植株基因組和表達(dá)水平變異分析發(fā)現(xiàn),二者具有顯著的相關(guān)性(r2=0.55,P＜0.000 1)。近年來(lái)隨著RNA-Seq技術(shù)的發(fā)展和成熟,人工合成甘藍(lán)型油菜表達(dá)水平的變異進(jìn)一步被證實(shí)。植物基因組多倍化過(guò)程中伴隨有基因表達(dá)的變化,這種變化模式包括多倍化后相比較親本基因表達(dá)的上調(diào)、表達(dá)變異傾向性和部分同源偏向表達(dá)等現(xiàn)象[58]。Jiang等[60]對(duì)人工合成甘藍(lán)型油菜F1～F4代及其親本轉(zhuǎn)錄組的研究表明,多倍體后代中基因表達(dá)并非親本基因組的簡(jiǎn)單疊加,而是存在大量的非加性表達(dá)。張大為[58]通過(guò)比較人工合成甘藍(lán)型油菜部分同源基因在親本和后代中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)親本中的表達(dá)模式大部分遺傳到合成四倍體中。冉麗萍[61]利用RNA-Seq技術(shù)分析了人工合成甘藍(lán)型油菜與其親本的基因表達(dá)差異,研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄組表達(dá)在人工合成種與親本表達(dá)中具有一定的差異,表達(dá)不存在偏好性;人工合成種中部分同源基因表達(dá)模式和親本一致,這一結(jié)論與張大為[58]的研究一致。人工合成種多倍化過(guò)程中,重排后染色體中DNA被修飾,轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座、反轉(zhuǎn)座子激活或是一些其他具有轉(zhuǎn)錄活性的基因組滲入等多個(gè)因素,導(dǎo)致其在進(jìn)化過(guò)程中沉默的同源基因重新表達(dá);另外,人工合成種中雙親細(xì)胞質(zhì)與母本細(xì)胞質(zhì)存在核質(zhì)互作和不兼容,細(xì)胞質(zhì)會(huì)對(duì)核基因組表達(dá)產(chǎn)生一定的影響,加之核仁顯性等諸多因素的影響,最終導(dǎo)致了多倍體后代基因表達(dá)水平表現(xiàn)出廣泛變異[4,39]。

3.3 小分子RNA變異研究

小分子RNA(sRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)20～30個(gè)核苷酸(nucleotide,nt)的非編碼 RNA分子,主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。其在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和應(yīng)答外界脅迫等方面具有重要功能[62]。近年來(lái)相關(guān)研究表明:sRNAs在多倍體形成過(guò)程中具有很重要的調(diào)節(jié)作用[63,64]。高通量測(cè)序的發(fā)展為研究sRNAs變異提供了很好的技術(shù)支持,sRNAs在人工合成甘藍(lán)型油菜后代遺傳變異的相關(guān)研究中已有報(bào)道。如:Fu等[65]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了人工合成甘藍(lán)型油菜早期世代(S1～S4)和親本的sRNAs變異,發(fā)現(xiàn)sRNAs和miRNAs數(shù)量在人工合成種中加倍,sRNAs的數(shù)量在人工合成種后代中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性,源于轉(zhuǎn)座子的sRNAs比例增加,與sRNAs產(chǎn)物相關(guān)的轉(zhuǎn)座子激活,基因調(diào)控更加復(fù)雜。目前,有關(guān)人工合成甘藍(lán)型油菜中sRNAs變異的相關(guān)報(bào)道較少,許多問(wèn)題還處在初步探索階段,如miRNAs靶基因的預(yù)測(cè)、定量表達(dá)以及在多倍化過(guò)程中的功能等諸多問(wèn)題均有待研究。

4 人工合成甘藍(lán)型油菜在育種中的應(yīng)用

4.1 人工合成甘藍(lán)型油菜的遺傳多樣性和雜種優(yōu)勢(shì)研究

大量研究表明,經(jīng)改良可獲得具有優(yōu)良性狀的人工合成甘藍(lán)型油菜,而且人工合成甘藍(lán)型油菜遺傳多樣性豐富,與天然甘藍(lán)型油菜遺傳差異大,可有效拓寬天然甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源遺傳多樣性,為甘藍(lán)型油菜育種開(kāi)辟一條新的途徑。Seyis等[66]研究了利用黃籽“Sarson”和甘藍(lán)為親本雜交選育的165個(gè)人工合成甘藍(lán)型油菜品系和40個(gè)春油菜品種的遺傳多樣性,AFLP分子標(biāo)記進(jìn)行聚類(lèi)分析表明人工合成品系遺傳多樣性豐富,相比春油菜品種具有更加豐富的遺傳基礎(chǔ)。Guo等[67]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)研究了96份人工合成甘藍(lán)型油菜和25份常規(guī)甘藍(lán)型油菜的遺傳多樣性,結(jié)果表明:人工合成種具有豐富的遺傳多樣性,可作為新的種質(zhì)資源用于育種和遺傳學(xué)研究。Becker等[68]對(duì)甘藍(lán)型油菜人工合成種與甘藍(lán)型油菜栽培種間遺傳距離及其與雜種優(yōu)勢(shì)之間的關(guān)系進(jìn)行了研究,結(jié)果表明雜種植株葉干重的中親優(yōu)勢(shì)與遺傳距離有顯著的相關(guān)性(r=0.55)。同時(shí),該團(tuán)隊(duì)利用RFLP分子標(biāo)記對(duì)12個(gè)來(lái)源不同的人工合成甘藍(lán)型油菜品系與春油菜品種“Korall”雜交F1的雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,F1較雙親產(chǎn)量均高,中親優(yōu)勢(shì)平均可達(dá)到30%左右[69]。趙勇國(guó)[70]從數(shù)量遺傳學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)等多個(gè)方面對(duì)人工合成甘藍(lán)型油菜在油菜育種中利用的潛力做了評(píng)估,認(rèn)為人工合成甘藍(lán)型油菜可以作為雜交油菜育種的一個(gè)重要的種質(zhì)資源。

4.2 人工合成甘藍(lán)型油菜的育種應(yīng)用

自發(fā)現(xiàn)人工合成甘藍(lán)型油菜潛在的育種價(jià)值后,很多學(xué)者將人工合成種引入到了甘藍(lán)型油菜育種過(guò)程中,成功獲得了一批優(yōu)良的甘藍(lán)型油菜資源。如:栗根義等[71]用黃籽白菜型油菜和甘藍(lán)人工合成了黃籽甘藍(lán)型油菜,并利用白菜型油菜雄性不育親本與甘藍(lán)雜交人工合成了甘藍(lán)型油菜雄性不育植株。牛應(yīng)澤等[72]以具有優(yōu)良性狀的人工合成甘藍(lán)型油菜與普通甘藍(lán)型油菜雜交,培育到了一個(gè)新甘藍(lán)型油菜胞質(zhì)雄性不育系,命名為“Bro cms”,并利用該不育系成功選育出了一系列具有長(zhǎng)角、大粒等性狀的新甘藍(lán)型油菜胞質(zhì)雄性不育系。富貴等[24]利用青海大黃為母本,與多個(gè)甘藍(lán)品種雜交人工合成了一批大粒甘藍(lán)型油菜,這些甘藍(lán)型油菜千粒重較高,介于5.482～7.453 g之間。Rahman等[73]以白菜型油菜黃籽沙遜與芥藍(lán)為親本人工合成了甘藍(lán)型油菜,并利用該人工合成種成功獲得了甘藍(lán)型油菜的黃籽品系。Rygullal等[74]曾以白菜型油菜和兩個(gè)不含芥酸的二倍體甘藍(lán)為親本,培育出了一批具有優(yōu)良性狀而且對(duì)黃萎病具有一定抗性的甘藍(lán)型油菜新種質(zhì)。Sza?a等[75]利用人工合成甘藍(lán)型油菜與攜帶卡諾拉油菜Ogura育性恢復(fù)基因(Rfo)的雙低冬油菜雜交,篩選得到了4個(gè)具有Rfo基因的雙低品系。由此可見(jiàn),作為甘藍(lán)型油菜育種的潛在資源,人工合成甘藍(lán)型油菜不僅豐富了現(xiàn)有甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源,而且在甘藍(lán)型油菜育種中得到了廣泛的應(yīng)用。值得注意的是,多數(shù)人工合成種芥酸和硫甙含量較高,不能直接用于育種,需進(jìn)行品質(zhì)改良。

5 展望

對(duì)人工合成甘藍(lán)型油菜的研究已經(jīng)進(jìn)行了近80年,從方法研究到人工合成甘藍(lán)型油菜品系選育及其雜種優(yōu)勢(shì)的利用研究,這些工作為豐富甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源和甘藍(lán)型油菜的育種奠定了基礎(chǔ);與此同時(shí),對(duì)于蕓薹屬A-C基因組之間進(jìn)化的研究也取得了豐碩的成果,尤其是A-C基因組異源多倍化后基因組水平、基因表達(dá)及表觀遺傳學(xué)變異的研究,為進(jìn)一步探索植物的進(jìn)化和起源模式及其他種屬異源多倍體的進(jìn)化提供了理論基礎(chǔ)。今后對(duì)于人工合成甘藍(lán)型油菜的研究一方面要注重在育種中的利用,尤其是對(duì)具有優(yōu)良性狀的二倍體親本進(jìn)行挖掘以獲得優(yōu)質(zhì)的人工合成種,便于對(duì)現(xiàn)有的甘藍(lán)型油菜進(jìn)行改良;另一方面要借助一些新穎、先進(jìn)的生物技術(shù)方法對(duì)人工合成種發(fā)生的變異進(jìn)行研究,前人的研究大多利用傳統(tǒng)的分子標(biāo)記技術(shù),具有一定的局限性;此外,對(duì)于人工合成甘藍(lán)型油菜后代的基因組變異、表型變異及表觀遺傳學(xué)變異相互關(guān)系的研究需進(jìn)一步加強(qiáng),這將有助于推動(dòng)甘藍(lán)型油菜優(yōu)良基因資源的開(kāi)發(fā)及異源多倍體變異產(chǎn)生機(jī)理的深層次探究。