樊 佳, 韓 煦, 陶榆瑋, 徐 璕, 楊富強(qiáng), 汪 紅, 鄭冬超

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 四川 成都 610065)

芽孢是芽孢桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌生長到一定階段形成的一種抗逆性很強(qiáng)的休眠體結(jié)構(gòu),也叫內(nèi)生孢子,通常為圓形或橢圓形。能否產(chǎn)生芽孢、芽孢的形狀、芽孢在芽孢囊中的位置、芽孢囊是否膨大等特征是細(xì)菌分類的重要指標(biāo)[1]。細(xì)菌的芽孢染色是微生物教學(xué)中的經(jīng)典實(shí)驗(yàn),本科實(shí)驗(yàn)中常選取枯草芽孢桿菌作為實(shí)驗(yàn)材料,通過孔雀綠初染以及番紅復(fù)染,觀察芽孢形成各個階段的形態(tài)特征,從而使學(xué)生更充分地了解芽孢的形成過程[1-4]。

芽孢染色實(shí)驗(yàn)需要選取適當(dāng)菌齡的菌株作為實(shí)驗(yàn)材料,芽孢成熟度、芽孢與營養(yǎng)體細(xì)胞的比例等都會影響實(shí)驗(yàn)效果,待觀察菌株的培養(yǎng)條件對實(shí)驗(yàn)效果有著重要影響。在目前本科教學(xué)中普遍使用的多個版本的微生物實(shí)驗(yàn)教材中,均沒有針對適宜枯草桿菌芽孢觀察的具體培養(yǎng)條件給出明確說明[4-6],實(shí)驗(yàn)教師只能依據(jù)經(jīng)驗(yàn)準(zhǔn)備菌種材料,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的隨機(jī)性太大,學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中不易找到芽孢,或無法同時觀察到不同生成階段的芽孢。目前文獻(xiàn)報道提高芽孢產(chǎn)率[5-9]以及芽孢形成機(jī)理[10]的研究比較多,很少有觀察枯草桿菌芽孢形成過程的最佳培養(yǎng)條件的研究。

本實(shí)驗(yàn)在控制接種菌的初始狀態(tài)及菌液濃度前提下,通過改變培養(yǎng)溫度和時間2個最易操作的變量,以芽孢成熟度為標(biāo)準(zhǔn),尋找最適于觀察的培養(yǎng)條件,使學(xué)生能更容易地觀察到芽孢形成各個階段的形態(tài)特征和芽孢的形成過程,提高學(xué)生做實(shí)驗(yàn)的成功率。

1 材料與儀器設(shè)備

1.1 材料

材料菌種：枯草芽孢桿菌為四川大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體及固體培養(yǎng)基。

染色劑：5%孔雀綠水溶液，番紅染液。

1.2 儀器設(shè)備

恒溫箱，水浴鍋，酒精燈，培養(yǎng)皿(直徑9 cm)，載玻片，接種環(huán)，Olympus顯微影像分析系統(tǒng)(1130萬像素數(shù)碼CCD、最高分辨率1280像素×1024像素)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌種活化

冷凍保藏的菌種經(jīng)斜面接種活化后,接入液體培養(yǎng)基,測定其在600 nm的吸光度值。取少量培養(yǎng)前菌種制片并染色鏡檢其生長狀態(tài)。調(diào)整細(xì)菌濃度和培養(yǎng)狀態(tài)至適宜程度后接種培養(yǎng)。為了控制接種菌的初始狀態(tài),實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一接種菌懸液濃度使吸光度A600 nm=0.44,冷凍菌種活化48 h。

2.2 菌種培養(yǎng)

取200 μL調(diào)整好的菌種懸液涂布于平板上倒置培養(yǎng)；將培養(yǎng)皿平均放入25、30、35、40 ℃的培養(yǎng)箱中,于24、30、36、42、48、54 h后取菌種制片觀察；隨后再將同一生長狀態(tài)的菌懸液涂布平板,放置在37 ℃箱中,于24、30、36、42、48、54 h后取菌種制片觀察。以上所有實(shí)驗(yàn)步驟均進(jìn)行了多次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 制片及染色

干燥固定后用浸染法進(jìn)行芽孢染色:將載玻片放入加熱的孔雀綠染液(50 ℃水浴)中浸染20～25 min,取出后緩水流沖去多余染液；再用番紅復(fù)染1.5 min,沖去多余染液后烘干；用油鏡觀察并攝像。鏡檢結(jié)果通過顯微攝像,客觀評價枯草桿菌芽孢生長狀態(tài)[5-7]。

2.4 鏡檢評價標(biāo)準(zhǔn)

以芽孢成熟度作為鏡檢評價標(biāo)準(zhǔn)，具體分級如下:

0級:所有營養(yǎng)體細(xì)胞均沒有芽孢產(chǎn)生；

I級:有極少量芽孢形成初期的營養(yǎng)體細(xì)胞；

II級:有數(shù)量較多芽孢形成初期的營養(yǎng)體細(xì)胞,沒有游離芽孢出現(xiàn)；

III級:既有芽孢形成初期的營養(yǎng)體細(xì)胞,又有游離的芽孢,二者比例約為1∶1；

IV級:大部分為游離的芽孢,有少量芽孢形成初期的營養(yǎng)體細(xì)胞;

V級:全部為游離芽孢或基本全為游離芽孢。

3 結(jié)果與分析

圖1為培養(yǎng)前初始菌株的芽孢染色圖,可以觀察到初始營養(yǎng)體細(xì)胞形態(tài)細(xì)長,未產(chǎn)生芽孢。

圖1 培養(yǎng)前初始菌株芽孢染色

不同溫度和時間條件下的枯草桿菌芽孢生長狀態(tài)見圖2。從圖2可以觀察到:在同一溫度下,隨著時間的推移,營養(yǎng)體細(xì)胞形態(tài)由細(xì)長狀變?yōu)榇侄虪?芽孢數(shù)量逐漸增多；而在同一時間內(nèi),隨著溫度的升高,芽孢形成數(shù)量也呈上升趨勢。在25 ℃下芽孢形成數(shù)量最少,24～36 h沒有芽孢形成,42～54 h有極少量芽孢形成初期的營養(yǎng)體細(xì)胞。30 ℃培養(yǎng)時,24 h沒有芽孢形成,30～48 h有極少量芽孢形成初期的營養(yǎng)體細(xì)胞,56 h芽孢數(shù)量較多,但沒有成熟脫落的芽孢出現(xiàn)。35 ℃培養(yǎng)時,24 h沒有芽孢形成,30 h有少量芽孢形成,42～48 h芽孢與營養(yǎng)體細(xì)胞比例適中,既有芽孢形成初期的營養(yǎng)體細(xì)胞,也有成熟的芽孢,兩者比例約為1∶1；54 h大多為游離芽孢。40 ℃培養(yǎng)時,24 h即產(chǎn)生了芽孢,30～36 h既有營養(yǎng)體細(xì)胞也有游離芽孢,42～54 h時多為成熟脫落的芽孢。雖然40 ℃培養(yǎng)36 h也能觀察到不同形成階段的芽孢,但此溫度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在2個重大缺陷:一是40 ℃下芽孢生長進(jìn)度過快,易錯過最佳觀察期；二是高溫易導(dǎo)致菌體死亡,使得初染的染色效果不佳,大量應(yīng)被孔雀石綠染為藍(lán)綠色的芽孢呈現(xiàn)出淡綠色或白色,部分甚至被復(fù)染的番紅染液染成紅紫色,最終觀察到的芽孢顏色駁雜,因此不建議把40 ℃列為適宜培養(yǎng)溫度。從圖2可以初步得到如下結(jié)論:在25～30 ℃的溫度范圍內(nèi),枯草桿菌培養(yǎng)24～54 h尚不能形成成熟脫落的芽孢；在35～40 ℃的溫度范圍內(nèi),枯草桿菌可以進(jìn)行完整的發(fā)育過程,但在40 ℃下因溫度過高使得觀察效果不佳,故應(yīng)選取稍低的溫度作為培養(yǎng)條件。在實(shí)驗(yàn)設(shè)立的條件中,35 ℃培養(yǎng)42～48 h最適宜進(jìn)行芽孢的結(jié)構(gòu)特征觀察實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同溫度和時間條件下的枯草桿菌芽孢生長狀態(tài)

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并有參考文獻(xiàn)[9]指出37 ℃下枯草芽孢桿菌的產(chǎn)芽孢率較高,又在原有的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上增設(shè)了37 ℃這一溫度條件,對37 ℃下培養(yǎng)24～54 h枯草桿菌芽孢的生長狀態(tài)進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示:在37 ℃下,培養(yǎng)24 h即有零星芽孢產(chǎn)生；30 h只有形成初期的營養(yǎng)體細(xì)胞；36～42 h既有芽孢形成初期的營養(yǎng)體細(xì)胞,也有游離芽孢；48 h大部分為游離芽孢,有少量芽孢形成初期的營養(yǎng)體細(xì)胞,54 h只有游離芽孢。因此得出37 ℃培養(yǎng)36～42 h是進(jìn)行芽孢染色觀察實(shí)驗(yàn)的適宜培養(yǎng)條件。

圖3 37 ℃培養(yǎng)24～54 h枯草桿菌芽孢的生長狀態(tài)

以芽孢成熟度為評價標(biāo)準(zhǔn),對不同培養(yǎng)溫度和時間組合下的芽孢觀察效果進(jìn)行了評價，結(jié)果見表1?？芍?5 ℃條件下,24～36 h芽孢成熟度為0級,沒有芽孢產(chǎn)生。42～54h芽孢成熟度為I級,芽孢數(shù)目偏少,觀察效果不佳,不建議選取25 ℃作為培養(yǎng)溫度；30 ℃條件下,30～48 h芽孢成熟度為I級,54 h芽孢成熟度為II級；35 ℃條件下,42～48 h芽孢成熟度達(dá)到III級,此時產(chǎn)生大量的芽孢,既有芽孢形成初期的營養(yǎng)體細(xì)胞,又有成熟脫落的芽孢,兩者比例約為1∶1,有利于學(xué)生觀察芽孢形成各個階段的形態(tài)特征,從而更加充分地了解芽孢形成過程,54 h時芽孢成熟度為IV級。37 ℃條件下,36～42 h芽孢成熟度達(dá)到III級,48 h時芽孢成熟度為IV級,54 h時芽孢成熟度為V級；40 ℃條件下,42 h時芽孢成熟度達(dá)到IV級,48～54 h芽孢成熟度為V級。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中,芽孢數(shù)量過少、只有游離芽孢沒有芽孢形成初期的營養(yǎng)體細(xì)胞,都不利于學(xué)生觀察芽孢的形成過程。為了讓學(xué)生更好地觀察到各個時期的芽孢形態(tài),建議選取芽孢成熟度為III級,即35 ℃下培養(yǎng)42～48 h,以及37 ℃下培養(yǎng)36～42 h作為最佳培養(yǎng)條件[11-12]。

表1 不同培養(yǎng)溫度和時間組合下的芽孢成熟度評價

4 討論

芽孢染色實(shí)驗(yàn)需要選取適當(dāng)菌齡的菌株作為實(shí)驗(yàn)材料,幼齡菌尚未形成芽孢,而老菌齡芽孢囊已經(jīng)破裂,這些都會影響實(shí)驗(yàn)觀察效果。本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室條件,嚴(yán)格控制接種菌的初始狀態(tài)及濃度,改變溫度和時間對產(chǎn)芽孢影響最顯著的變量[6],全程監(jiān)測記錄芽孢形成過程。實(shí)驗(yàn)趨勢顯示:在同一溫度條件下,隨著時間的增長,芽孢成熟度逐漸增加；在同一時間內(nèi),隨著溫度的增加,芽孢成熟度逐漸增加,溫度與時間與芽孢成熟度呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:選擇芽孢含量較少的初始菌,在35 ℃下培養(yǎng)42～48 h或在37 ℃下培養(yǎng)36～42 h可獲得最佳視野,裝片中芽孢和營養(yǎng)體細(xì)胞數(shù)量適宜,易清晰觀察到芽孢形成各個時期的狀態(tài),適于作為觀察材料。該結(jié)果為芽孢染色實(shí)驗(yàn)中菌株的培養(yǎng)時間和溫度提供了參考,提高了實(shí)驗(yàn)的效率和成功率,方便了教學(xué)材料的準(zhǔn)備,適于在普通本科微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣應(yīng)用。

References)

[1] 孫桐,李忠.國外對芽孢桿菌屬芽孢長久存活機(jī)制的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,1996,24(2):78-80.

[2] 惠明,竇麗娜,田青,等.枯草芽孢桿菌的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(27):11623-11624,11627.

[3] 李明,雙寶,李海濤,等.枯草芽孢桿菌的研究與應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)報,2009,40(9):111-114.

[4] 沈萍，陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:高等教育出版社,2007.

[5] 唐麗杰.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社,2005.

[6] 胡開輝. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:中國林業(yè)大學(xué)出版社,2004.

[7] 鄭冬超,樊佳,王雨昊,等.浸染法改良細(xì)菌芽胞染色實(shí)驗(yàn)的探索[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2015,32(7):191-192，209.

[8] 郭夏麗,狄源寧,王巖.枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化[J].中國土壤與肥料,2012(3):99-103.

[9] 胡小加,謝立華,余常兵,等.枯草芽孢桿菌Tu-100的芽孢形成與發(fā)酵條件優(yōu)化的研究[C]//第四屆全國微生物資源學(xué)術(shù)暨國家微生物資源平臺運(yùn)行服務(wù)研討會論文集.2012:112.

[10] 劉寬博,謝遠(yuǎn)紅,熊利霞,等.一株產(chǎn)抗單增李斯特菌細(xì)菌素的枯草芽孢桿菌C3 產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化[J].飼料研究,2016(7):45-53.

[11] 翟蓓蓓,閆志宇,李術(shù)娜,等.乙草胺降解菌株枯草芽孢桿菌L3 產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2016, 45(10):98-102.

[12] Douglas Higgins, Jonathan Dworkin. Recent progress in Bacillus subtilis sporulation[J].FEMS Microbiol Rev, 2012,36(1): 131-148.