，　　，　　，　　，　　，，　,2，　,2

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，　貴陽(yáng) 550025；　2.國(guó)家小麥改良中心貴州分中心，　貴州 貴陽(yáng) 550025)

硬粒小麥(TriticumDurum，AABB，2 n=28)是世界重要的糧食作物之一,最早在美國(guó)和意大利種植較多，后來(lái)傳播到北非、中東、歐洲等地并逐步擴(kuò)散到世界各地。如今硬粒小麥播種面積約占世界小麥總面積的十分之一，僅次于普通小麥,居栽培小麥的第二位。硬粒小麥?zhǔn)且环N四倍體栽培小麥[1]，其籽粒蛋白質(zhì)及面筋含量都較普通小麥高，面筋較普通小麥硬，不能拉長(zhǎng)，適合生產(chǎn)琥珀色、耐煮、光滑可口的通心粉，用硬粒小麥做的面條耐煮且有韌勁，因此又叫通心粉小麥。硬粒小麥還可以與普通小麥搭配磨粉來(lái)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)面包和其它面食品。硬粒小麥?zhǔn)橇扼w普通小麥的初級(jí)基因庫(kù)，含有豐富的抗性基因，對(duì)條銹、葉銹、散黑穗病和腥黑穗病等病具有較好的抗性，具有較高的育種價(jià)值[2-3]。

圖2　硬粒小麥(Sauwne 20) 的A和B基因組的FISH核型

DNA重復(fù)序列可以用于染色體辨別、基因組組成及進(jìn)化分析，外源遺傳物質(zhì)檢測(cè)等多項(xiàng)研究。Mukai等[4]以高度重復(fù)序列pSc 119.2和pAs 1為探針識(shí)別了B組和D組所有染色體以及小麥的1 A、4 A和5 A 染色體，并創(chuàng)立了中國(guó)春小麥的B基因組和D基因組染色體核型模式圖。Pedersen等[5]成功地使用pAsI和pHvG 38兩個(gè)重復(fù)序列探針識(shí)別了小麥所有的21對(duì)染色體。 Cuadrado和Jouve[6]在黑麥染色體制片上用pTa 71、pTa 794、pSc 34、pSc 74和pSc 119.2重復(fù)序列探針進(jìn)行了3次熒光原位雜交，從而識(shí)別了黑麥的全部染色體。目前，對(duì)硬粒小麥的FISH核型方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究擬對(duì)硬粒小麥染色體進(jìn)行雙色FISH分析，以期了解硬粒小麥染色體的FISH特點(diǎn)，建立其FISH核型，為硬粒小麥在小麥遺傳育種上的利用和深入研究提供參考。

1　材料與方法

1.1　材　料

試驗(yàn)材料為從意大利引入的硬粒小麥品種Sauwne 20，該品種具有矮桿、千粒重大、白粒、全玻璃質(zhì)等特點(diǎn)，并且對(duì)條、葉、稈銹病和白粉病等病表現(xiàn)高抗至免疫[7]，是小麥白粉病抗性的鑒別寄主。

1.2　染色體制片

將種子置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中于常溫下發(fā)芽，待根長(zhǎng)至2 cm左右時(shí)，剪取根尖用N2O處理2 h，在90%冰醋酸中固定10 min,用蒸餾水沖洗3遍后切取根尖分生區(qū)，酶解滴片，在OLMPUS BX 60顯微鏡下鏡檢，選取分裂相好的片子保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3　熒光原位雜交分析

FISH技術(shù)參見(jiàn)Han等[8]方法。選擇FISH效果好的細(xì)胞用Cellsens Standard攝像系統(tǒng)照相。選取5個(gè)分裂相好且染色清晰的細(xì)胞用于FISH核型分析，以得到準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果與分析

以O(shè)ligo-pTa 535-2(紅色)和Oligo-pSc 119.2-1(綠色)重復(fù)序列為探針對(duì)硬粒小麥Sauwne 20根尖細(xì)胞染色體進(jìn)行雙色FISH分析(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sauwne 20包括14對(duì)染色體，其染色體上的Oligo-pTa 535-2紅色信號(hào)相對(duì)較弱且少，而Oligo-pSc 119.2-1綠色信號(hào)較強(qiáng)且豐富。

Sauwne 20的1 A染色體短臂端部和長(zhǎng)臂中間分別具有Oligo-pTa 535-2信號(hào)(圖2)。2 A染色體短臂端部及近著絲點(diǎn)處分別有明亮的Oligo-pTa 535-2信號(hào)。3 A染色體著絲點(diǎn)處有明亮的Oligo-pTa 535-2信號(hào)。4 A染色體長(zhǎng)臂近端部有Oligo-pTa 535-2信號(hào), 長(zhǎng)臂端部有Oligo-pSc 119.2-1綠色信號(hào)。5 A染色體長(zhǎng)臂中間存在2對(duì)弱的Oligo-pTa 535-2信號(hào)。6 A染色體短臂端部和近著絲點(diǎn)處分別有Oligo-pTa 535-2信號(hào)。7 A染色體長(zhǎng)臂近端部和近著絲點(diǎn)處分別有微弱的Oligo-pTa 535-2信號(hào)。

注：Oligo-pTa 535-2探針為紅色，Oligo-pSc 119.2-1探針為綠色，背景染色體由DAPI復(fù)染為藍(lán)色；比例尺為10 μm。下同。圖1　硬粒小麥(Sauwne 20)根尖細(xì)胞染色體的FISH核型

Sauwne 20在1 B染色體長(zhǎng)臂端部和中間分別有Oligo-pSc 119.2-1信號(hào)。2 B染色體長(zhǎng)臂、短臂端部及長(zhǎng)臂中間分別有Oligo-pSc 119.2-1信號(hào)。3 B染色體短臂端部有Oligo-pSc 119.2-1和Oligo-pTa 535-2兩種信號(hào)，長(zhǎng)臂端部有Oligo-pTa 535-2信號(hào)。4 B染色體上具有較豐富的Oligo-pSc 119.2-1信號(hào)，在短臂端部、長(zhǎng)臂中間與端部分別具有較強(qiáng)的Oligo-pSc 119.2-1信號(hào)。5 B染色體短臂端部和近端部有較強(qiáng)的Oligo-pSc 119.2-1信號(hào)。6 B染色體長(zhǎng)臂和短臂端部及長(zhǎng)臂中間分別具有Oligo-pSc 119.2-1信號(hào)；短臂端部及中間分別有Oligo-pTa 535-2信號(hào)。7 B染色體在短臂近端處和長(zhǎng)臂端部、中間分別有明顯的Oligo-pSc 119.2-1信號(hào)；長(zhǎng)、短臂近端處分別有Oligo-pTa 535-2信號(hào)。

硬粒小麥Sauwne 20與Tang等[9]報(bào)道的中國(guó)春普通小麥的A組和B組染色體的FISH核型基本相似，但又有一定的差別。Sauwne 20的1 B和4 B染色體長(zhǎng)臂近端處比中國(guó)春小麥多1對(duì)Oligo-pTa 535-2信號(hào)。Sauwne 20的3 B染色體短臂近端處比中國(guó)春小麥多1對(duì)Oligo-pTa 535-2信號(hào)。Sauwne 20的6 B染色體短臂近端處比中國(guó)春小麥多1對(duì)Oligo-pSc 119.2-1信號(hào)信號(hào)。Sauwne 20的7 B染色體長(zhǎng)臂端部和近端處分別比中國(guó)春小麥多1對(duì)Oligo-pSc 119.2-1和Oligo-pTa 535-2信號(hào)。

3　討　論

建立植物的FISH核型對(duì)研究植物分類(lèi)和進(jìn)化具有重要的意義[10-11]。董磊等[12]對(duì)擬斯卑爾脫山羊草材料進(jìn)行了FISH分析，發(fā)現(xiàn)Oligo-pTa 535信號(hào)主要分布在小麥的A組和D組染色體上，Oligo-pSc 119.2信號(hào)主要分布在小麥的B組染色體上，不同來(lái)源的擬斯卑爾脫山羊草與小麥B染色體組的FISH核型存在明顯差異；認(rèn)為擬斯卑爾脫山羊草染色體上含有豐富的與pSc 119.2高度同源的重復(fù)序列，分布上具有遺傳多樣性。葛群等[13]利用普通小麥品種綿陽(yáng)11作母本,抗病的威寧黑麥(ScealecerealeL.)作父本,在其雜交和回交后代中分別鑒定出一個(gè)1 R和5 R單體附加系；研究發(fā)現(xiàn)黑麥染色體1 R和5 R單體附加系可以誘導(dǎo)小麥染色體變異。羅巧玲等[14]分析了390份小麥-黑麥種質(zhì)材料，指出3份六倍體小黑麥與2份八倍體小黑麥所含的黑麥染色體不完全相同；八倍體小黑麥中有1對(duì)來(lái)源于黑麥的小染色體,而六倍體小黑麥中沒(méi)有類(lèi)似小染色體。Tang等[15]以O(shè)ligo-pTa 535-1和Oligo-pSc 119.2-1為探針進(jìn)行FISH分析，并結(jié)合GISH技術(shù)對(duì)小黑麥衍生種的染色體結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行了分析。劉成等[16]利用Oligo-pTa 535-1、Oligo-pSc 119.2-1和(GAA)8探針對(duì)智利大麥進(jìn)行FISH分析，有效辨別了智利大麥的每一條染色體。Linc等[17]則以重復(fù)序列pSc 119.2和Afa family為探針將二倍體長(zhǎng)穗偃麥草的7對(duì)染色體全部區(qū)分，建立了二倍體長(zhǎng)穗偃麥草的FISH核型，并對(duì)其附加系進(jìn)行了鑒定。

本研究利用雙色FISH技術(shù)可在染色體水平上準(zhǔn)確辨別硬粒小麥Sauwne 20的每一染色體，并建立Sauwne 20的FISH核型。Sauwne 20染色體上的Oligo-pTa 535-2紅色信號(hào)相對(duì)較弱且少，而Oligo-pSc 119.2-1綠色信號(hào)較強(qiáng)且豐富。Sauwne 20的FISH核型與Tang等[9]報(bào)道的中國(guó)春小麥A和B組染色體的FISH核型相似，但又有一定的差別；其差異可能是由于試驗(yàn)材料不同，不同小麥材料間DNA重復(fù)序列具有遺傳多樣性。Sauwne 20染色體結(jié)構(gòu)變異可能是該材料形成過(guò)程中，染色體發(fā)生重復(fù)、倒位、易位、缺失等現(xiàn)象而導(dǎo)致染色體重復(fù)序列的變化，從而形成FISH信號(hào)的多樣性[18]。

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3　討　論

本研究以三白草作為材料分離AP1基因，通過(guò)RACE方法快速克隆出全長(zhǎng)cDNA，獲得全長(zhǎng)cDNA，通過(guò)測(cè)序分析，確定該基因?yàn)? 076 bp的全長(zhǎng)cDNA序列，共編碼245個(gè)氨基酸。AP1基因既屬于花分生組織特征基因，又是花器官形態(tài)特征基因，AP1基因具有促進(jìn)植物開(kāi)花的作用[6]。

AP1基因在花器官發(fā)育中起關(guān)鍵作用。在花發(fā)育的ABCDE模型中，AP1基因既屬于A類(lèi)基因，是萼片和花瓣正常發(fā)育所必需的，同時(shí)又能激活B類(lèi)基因。AP1基因突變使一些花變成花序，導(dǎo)致萼片和花瓣發(fā)育異常。被子植物中有關(guān)花發(fā)育方面的研究主要集中在擬南芥、金魚(yú)草和矮牽牛等模式植物中，AP1基因在這些高等真雙子葉植物中的功能、表達(dá)以及氨基酸序列具有相似性。而在被子植物基部類(lèi)群的三白草，其花序沒(méi)有花萼和花瓣，但開(kāi)花時(shí)頂端3片苞葉變白，通過(guò)RT-PCR基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)在白色花瓣?duì)畎~中AP1基因有表達(dá)。AP1在三白草植株開(kāi)花時(shí)頂端苞片變白過(guò)程中有明顯上調(diào)，而幼葉中幾乎沒(méi)有表達(dá)，這也許與A-class基因的異位表達(dá)有關(guān)系，所以在無(wú)被花的三白草中有可能出現(xiàn)花瓣異位表達(dá)的現(xiàn)象。

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