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(新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所/兵團(tuán)作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，　新疆 石河子 832000)

種子自然成熟后即進(jìn)入衰老過程，生活力逐漸喪失，這被稱為種子的老化。老化是種子貯藏過程中普遍存在的一種現(xiàn)象，是一個(gè)伴隨著種子貯藏時(shí)間的延長而發(fā)生和發(fā)展的、自然而不可避免的過程[1-2]。種子的老化是不可逆轉(zhuǎn)的。在這個(gè)過程中種子會(huì)產(chǎn)生劣變，包括種皮變色、質(zhì)膜透性增加等，影響種子的萌發(fā)、幼苗生長，以致于生產(chǎn)中對作物產(chǎn)量產(chǎn)生較大影響。為了保持種質(zhì)的活力和遺傳完整性，世界上作物種質(zhì)資源約90%以種子的形式保存于低溫庫中(FAO,1996)。盡管現(xiàn)代低溫庫貯藏技術(shù)可以延長種子壽命，但隨著貯存時(shí)間的延長種子仍會(huì)發(fā)生劣變，對種質(zhì)資源的保存、開發(fā)和利用等都產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[3-4]。因此，種子老化相關(guān)研究一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)[5]。

種子的老化可以分為自然老化和人工加速老化2種。研究人員采取人工加速老化的方法模擬種質(zhì)老化過程，在生理生化層面及分子水平上來檢測不同品種種子的抗老化能力、研究種質(zhì)老化的規(guī)律。人工加速老化的方法主要有高溫高濕法，熱水法等方法。目前，高溫高濕法在棉花、小麥和花生[3，5-7]等作物種子老化研究中應(yīng)用比較廣泛，對熱水加速老化的研究報(bào)道很少。高溫高濕法處理種子在飽和濕度下容易滴水，造成處理不均勻。另外，長時(shí)間高溫高濕條件下種子表面往往會(huì)發(fā)生霉變，影響后續(xù)的活力和生化指標(biāo)等的鑒定[6]。而熱水老化不但處理周期相對短，操作方法簡便，更為重要的是種子與熱水能夠充分接觸，處理非常均勻，效果比較理想。本研究采用65 ℃熱水對3個(gè)陸地棉品種(系)加速老化，不同水平的處理后通過檢測供試棉花種子的活力指標(biāo)、電導(dǎo)率及遺傳完整性的變化，明確不同棉花種品抗老化能力差異，探索棉花種子老化規(guī)律，以期為棉花品種抗老化能力的鑒定和抗老化種質(zhì)的篩選提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材　料

供試材料為本單位自育的2個(gè)早熟陸地棉品系799、223和新陸早36號。供試種子在加速老化處理前統(tǒng)一調(diào)整水分至5%，確保老化處理后各項(xiàng)檢測結(jié)果具備可比性。

1.2　測定方法

1.2.1人工加速老化方法

參照黃瑤等[7]的方法，挑選均勻飽滿的棉種裝入尼龍網(wǎng)袋，在65 ℃恒溫水浴鍋中分別設(shè)置10，20，30，40，50，60 min和70 min 7個(gè)老化時(shí)間，于室溫下晾干平衡水分，并以不處理種子為對照。

1.2.2種子活力檢測方法

大號發(fā)芽盒內(nèi)以蛭石為基質(zhì)，每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)30粒，置于低溫強(qiáng)光照培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃恒溫發(fā)芽，每天調(diào)查發(fā)芽數(shù)，以第4天發(fā)芽的種子數(shù)計(jì)算發(fā)芽勢，第7天發(fā)芽的種子數(shù)計(jì)算發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。播種后第8天計(jì)數(shù)，幼苗沖洗干凈，晾干表面水分測量株高，計(jì)算活力指數(shù)。

發(fā)芽勢(%)=第4天的發(fā)芽種子數(shù)/播種粒數(shù)×100%；

發(fā)芽率(%)=第7天發(fā)芽種子數(shù)/播種粒數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt；

活力指數(shù)(VI)=GI×S。

式中Gt為計(jì)數(shù)期內(nèi)第t天的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為不同發(fā)芽天數(shù)，S為幼苗單株株高。

1.2.3電導(dǎo)率檢測方法

每個(gè)材料各個(gè)處理分別取30粒種子，以10粒為一個(gè)重復(fù)，稱重后剝?nèi)シN皮，雙蒸水沖洗3遍。用干凈的濾紙吸干表面水分后分別裝入200 mL錐形瓶，加入40 mL雙蒸水浸泡24 h，用DDS-12 W微機(jī)型電導(dǎo)儀檢測25 ℃下浸出液電導(dǎo)值，沸水蒸煮30 min后再次檢測電導(dǎo)值，計(jì)算相對電導(dǎo)率。

相對電導(dǎo)率(%)=浸出液電導(dǎo)值/蒸煮后電導(dǎo)值×100%。

1.2.4DNA提取方法

參考匡猛等[8]的方法提取棉花基因組DNA。樣品研磨稍作改動(dòng)，將去皮且完整的棉籽放于研缽中，加入少量石英砂快速研磨成粉，加入提取液(提取液組成為：1% SDS，0.01 mol/L EDTA，0.705 mol/L NaCl，0.05 mol/L tris，0.5%山梨醇，1%PVP和 1%-巰基乙醇)，酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液各抽提1次，預(yù)冷異丙醇沉淀DNA。75%乙醇洗滌2次，室溫下自然晾干后1×TE充分溶解備用。為消除提取過程中產(chǎn)生的誤差，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，重復(fù)間使用均勻一致的雙粒種子。

1.2.5SSR擴(kuò)增

SSR擴(kuò)增采用20 L體系：Buffle緩沖液(含1×Mg2+3 mmol/L)，dNTPs 200 mol/L，Taq酶0.05 U/L，引物 0.25 mol/L，DNA模板1 L(濃度為10 ng/L)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸 45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。4%瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，電極緩沖液為1×TAE，電泳時(shí)間為45 min，用Marker 2000作對照。

1.3　數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel和IBM SPSS Statistics 20軟件分別進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　熱水老化對棉花種子發(fā)芽勢的影響

發(fā)芽勢反映在一定的時(shí)間內(nèi)種子發(fā)芽的整齊度，是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，種子在大田中短時(shí)間內(nèi)快速整齊的發(fā)芽，不僅能為田間的出苗打好基礎(chǔ)，也可避開不可預(yù)測的例如倒春寒等不良天氣的影響。由圖1可知，棉花種子在經(jīng)過65 ℃ 10，20 min和30 min處理后，3個(gè)棉花材料的發(fā)芽勢較對照基本沒有顯著的變化。從40 min的處理時(shí)間開始，所有材料發(fā)芽勢都有了明顯的降低，到了處理70 min時(shí)，799和223發(fā)芽勢均低于20%，新陸早36號也降到了80%以下，3個(gè)材料發(fā)芽勢具有一致的變化規(guī)律。另外，新陸早36號發(fā)芽勢各個(gè)處理水平均處在最高的水平，而且不同處理之間變化幅度也不大。緊隨其后的是799，223則最差，發(fā)芽勢最弱，而且處理之間變化顯著。

表1熱水老化后棉花種子發(fā)芽率和活力的變化

老化時(shí)間(min)　　　　　新陸早36號　　　　　　　　　　　　799　　　　　　　　　　　　　　223　　　　　　　發(fā)芽率(%)活力指數(shù)發(fā)芽率(%)活力指數(shù)發(fā)芽率(%)活力指數(shù)098．9±1．92a21．9±0．88c100．0±0．00a24．9±1．68a97．8±1．92ab23．9±0．54a1097．8±3．85a22．7±1．06bc98．9±1．92a29．2±2．42a100．0±0．00a27．7±3．13a20100±0．00a24．8±1．75abc98．9±1．92a23．7±1．49a98．9±1．92ab24．9±1．72a3097．8±1．92a28．7±1．43a98．9±1．92a29．8±1．23a87．8±3．85ab24．1±1．23a4091．1±1．92ab27．1±2．00ab86．7±3．33a25．5±2．43a73．3±8．82c17．1±2．30b5080．0±5．77c22．6±2．86bc66．7±15．28b14．2±5．72b85．6±3．85bc18．0±1．35b6085．6±1．92bc21．8±0．56c40．0±6．67c5．9±1．44c28．9±8．39d3．8±0．83c7070．0±6．67d16．3±1．87d10．0±3．33d0．7±0．66c6．7±3．33e0．5±0．53c

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

圖1　熱水老化對棉花種子發(fā)芽勢的影響

2.2　熱水處理對棉花種子活力的影響

由表1可以看出，在10，20 min和30 min的熱水處理后3個(gè)供試材料的種子發(fā)芽率均在85%以上。甚至在40 min的時(shí)候，新陸早36號和799種子的發(fā)芽率沒有顯著的降低。隨著老化時(shí)間的進(jìn)一步延長，所有材料發(fā)芽率出現(xiàn)波動(dòng)，開始逐漸降低。3個(gè)材料種子活力指數(shù)變化總趨勢是先增加后變小，在30 min到40 min的處理之間有一個(gè)拐點(diǎn)，慢慢降低。推測短時(shí)間可能活化了棉花種子內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)，激活了酶活力，所以提高了種子活力[9]。

熱水老化后同條件下3個(gè)材料的發(fā)芽率和活力也存在差異。從表1可以看出，30 min及之前的種子發(fā)芽率和活力，799相對于其它2個(gè)材料保持比較高的水平，新陸早36號居中，223表現(xiàn)最差。新陸早36號7個(gè)處理的發(fā)芽率和活力較其它材料都保持了較高水平，熱水老化處理70 min時(shí)發(fā)芽率和活力指數(shù)仍可達(dá)到70%和16.3，223表現(xiàn)相對最差。另外，品種間各處理發(fā)芽率和活力變化幅度新陸早36號也是降低最小的，799次之，223幅度最大。以上結(jié)果說明新陸早36號棉種抗老化能力最強(qiáng)，其次為799和223。

2.3　熱水老化對棉花種子膜透性的影響

電導(dǎo)率測定提供了一個(gè)間接測定質(zhì)膜完整性變化的方法[10]。大量研究表明，質(zhì)膜受損是種子劣變期間發(fā)生的主要生理變化之一[11-12]。相對電導(dǎo)率是反映植物細(xì)胞膜系統(tǒng)狀況的一項(xiàng)重要的生理生化指標(biāo)。逆境或受損情況下植物的細(xì)胞膜容易破裂，細(xì)胞膜蛋白受損導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)胞液外滲，相對電導(dǎo)率增大[13]。圖2顯示，在65 ℃熱水加速老化后，3個(gè)棉花材料種子細(xì)胞電解質(zhì)產(chǎn)生較為一致的變化。相對電導(dǎo)率值變化趨勢可分為2個(gè)階段：在10～30 min的處理間，棉花種子相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)下降的趨勢；而在40 min及更長時(shí)間的熱水老化處理之間，則表現(xiàn)為逐步增加的態(tài)勢。由此可見，不超過30 min的熱水浸種老化處理對棉花種子細(xì)胞膜沒有產(chǎn)生損傷或損傷較小，種子內(nèi)部電解質(zhì)沒有外滲，說明種子對短時(shí)間的老化處理具有一定的耐受力[9]。熱水處理超過30 min，棉花種子抗老化能力達(dá)到了極限，細(xì)胞膜表現(xiàn)出不同程度的損傷，細(xì)胞內(nèi)部電解質(zhì)開始大量外滲，相對電導(dǎo)率隨之增加，活力逐步降低，直至最后失去活力。

圖2　熱水老化對棉花種子電導(dǎo)率的影響

注：M為marker 2000;0～70 min為熱水老化時(shí)間。圖3　熱水老化對棉花種子基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的影響

3個(gè)棉花材料在相同處理水平上，種子細(xì)胞膜的透性存在明顯的差異。3個(gè)材料對照相對電導(dǎo)率雖存在差異，但新陸早36號的相對電導(dǎo)率都是最低，而且在30 min處理水平前后的變化幅度最小，799次之，223則變化最為劇烈。說明新陸早36號的抗老化能力最強(qiáng)，799居中，而223則較差。

2.4　熱水老化對種子遺傳完整性的影響

由圖3可知，供試3個(gè)材料隨著老化時(shí)間的延長，799和223擴(kuò)增產(chǎn)物中分子量接近500 bp的大片段在老化30 min后逐步變?nèi)趸蛘呦В煌瑫r(shí)，3個(gè)材料中處于100 bp和250 bp之間的小分子量的片段也是在30 min的處理時(shí)間后電泳條帶寬度變細(xì)，亮度逐漸地減弱。可見，熱水處理對棉花種子基因組DNA造成損傷，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起了核酸的降解。此結(jié)果與已有的老化研究報(bào)道一致[14-15]。而且是在處理時(shí)間為30 min起基因組DNA開始發(fā)生變化。

3　討論與結(jié)論

種子老化是一個(gè)復(fù)雜的過程，其影響因素是多方面的。即使在種質(zhì)資源庫的優(yōu)良條件可以保存一定的年限，但是種質(zhì)最終還是趨于死亡。在老化過程中，種子表現(xiàn)出發(fā)芽率、生活力降低、細(xì)胞膜透性增強(qiáng)等特點(diǎn)，同時(shí)種子內(nèi)部的遺傳物質(zhì)也在發(fā)生變化[2]。本研究中，熱水加速老化后的棉花材料發(fā)芽勢、發(fā)芽率及活力指數(shù)都有一個(gè)逐步降低的過程，而且在30 min和40 min的處理水平之間具有一個(gè)明顯的變化拐點(diǎn)：處理超過30 min后都呈現(xiàn)顯著的降低態(tài)勢。中國科學(xué)院昆明植物研究所陳虹穎博士與英國專家合作研究發(fā)現(xiàn)，種子老化過程是一個(gè)由基因控制的過程，而且老化過程啟動(dòng)了細(xì)胞程序性死亡，最終導(dǎo)致種子活力的喪失。通過對豌豆種子老化過程中種子活力與基因表達(dá)以及谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)之間的關(guān)系進(jìn)行了檢測分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)種子老化過程開始啟動(dòng)，雖然萌發(fā)率仍維持在100% 的水平，但部分DNA和RNA已開始降解[16]。本試驗(yàn)也有類似的結(jié)果。雖然棉花種子在40 min的老化處理后發(fā)芽指標(biāo)(發(fā)芽勢和發(fā)芽率)仍然保持在較高的水平，但種子活力已經(jīng)發(fā)生了明顯的降低。與此同時(shí)，棉花種子基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物也發(fā)生變化，出現(xiàn)了片段降解和片段弱化，說明熱水老化引起了棉花種子基因組DNA的損傷，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，核酸出現(xiàn)降解。

綜上所述， 65 ℃熱水能夠加速棉花種子老化。棉花種子對65 ℃熱水逆境在30～40 min存在一個(gè)臨界點(diǎn)。30 min處理棉花種子的發(fā)芽率及活力指數(shù)處于頂峰值，所以說此水平的處理有利于促進(jìn)棉花種質(zhì)活力的發(fā)揮，在大田生產(chǎn)中可利用這一規(guī)律來提高棉花田間的發(fā)芽率和種子活力，為后續(xù)的穩(wěn)產(chǎn)與豐產(chǎn)提供足額健壯的棉苗支撐。供試3個(gè)棉花材料抗老化能力存在差異，新陸早36號最強(qiáng)，其次是799和223。

參考文獻(xiàn):

[1]Anderson J D. Metabolic changes associated with senescence [J].Seed Science and Technology,1973(1):401-416.

[2]閆慧芳,夏方山,毛培勝.種子老化及活力修復(fù)研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2014,30(3):20-26.

[3]盧新雄,曹永生.作物種質(zhì)資源保存現(xiàn)狀與展望[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2001,3(3):43-47.

[4]沈一,劉永惠,陳志德.人工老化對花生種子營養(yǎng)成分的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(10)：79-81.

[5]孔治有,劉葉菊,覃鵬.40 ℃加速老化處理對小麥種子生理生化特性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(12):6 155-6 157.

[6]宋平.熱水加速老化處理對棉花種子活力的影響[J].種子,1990,9(6):28-30.

[7]黃瑤,喬愛民,孫敏.熱水加速老化黃瓜種子的試驗(yàn)研究[J].種子,2004,23(8)：11-12.

[8]匡猛,楊偉華,許紅霞,等.單粒棉花種子DNA快速提取方法[J].分子植物育種,2010,8(4)：827-831.

[9]張潔,郭數(shù)進(jìn),馬金虎.兩個(gè)大豆品種在人工加速老化過程中種子發(fā)芽和活力的變化[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,29(3):198-201.

[10]Delouche J C,Baskin C C.Accelerated aging techniques for predicting the relative storability of seed lots[J].Seed Science and Technology,1973(1):427-452.

[11]Basavarajappa B S,Shetty H S,Prakash H S.Membrane deterioration and other biochemical changes,associated with accelerated ageing of maize seeds[J].Seed Science and Technology,1991(19):279-286.

[12]張苗苗,趙彥,云錦鳳,等.老化處理對2種披堿草屬牧草種子生理生化的影響[J].種子,2014,31(4)：23-27.

[13]陳愛葵,韓瑞宏,李東洋,等.植物葉片相對電導(dǎo)率測定方法比較研究[J].廣東教育學(xué)院學(xué)報(bào),2010,30(5)：88-91.

[14]伍春蓮,喬愛民,孫敏.黃瓜老化種子基因組DNA的損傷與修復(fù)的RAPD研究[J].長江蔬菜(學(xué)術(shù)版),2009(14):15-18.

[15]李馳,盧新雄,陳曉玲,等.利用cDNA-AFLP技術(shù)分析老化棉花種子基因差異表達(dá)[J].棉花學(xué)報(bào),2007,19(4)：255-260.

[16]昆明植物所在種子老化研究中取得新進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)科技與信息,2013(24):23-23.